細(xì)胞凋亡-Hoechst 染色試劑盒

●  產(chǎn)品組成：

● 產(chǎn)品簡介：

Hoechst 33258也稱bisBenzimide H 33258或HOE 33258，分子式為C₂₅H₂₄N₆O·3HCl，分子量為533.88，CAS Number 23491-45-4。該染料是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，對細(xì)胞的毒性較低，常用于細(xì)胞凋亡檢測，染色后可用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測。Hoechst 33258也用于普通的細(xì)胞核染色、DNA染色。

Hoechst 33258的最大激發(fā)波長為346nm，最大發(fā)射波長為460nm，與雙鏈DNA結(jié)合后，最大激發(fā)波長為352nm， 最大發(fā)射波長為461nm。

Hoechst染色試劑盒(Hoechst Staining Kit)為您提供了一種經(jīng)典而又快速簡便的細(xì)胞凋亡檢測方法。細(xì)胞發(fā)生凋亡時，染色質(zhì)會固縮。所以Hoechst 33258染色后，在熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色有些發(fā)白。

按照每次使用0.5 ml染色液計算，該試劑盒可以使用100次。

● 貯存：

4℃避光保存，一年有效。

● 操作步驟：

一. 鐵壁細(xì)胞：

1.1 取潔凈蓋玻片在70%乙醇中浸泡5分鐘或更長時間，無菌超凈臺內(nèi)吹干或用無菌的PBS洗滌三遍，再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌一遍。將蓋玻片置于六孔板內(nèi)，種入細(xì)胞培養(yǎng)過夜，生長至50%-80%滿度。

1.2刺激細(xì)胞發(fā)生凋亡后，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 ml固定液，固定10分鐘或更長時間(可4℃過夜)。

1.3去盡固定液，用PBS洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體。洗滌時宜用搖床或手動晃動。

1.4加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，37℃避光染色10-15分鐘，手動晃動數(shù)次。

1.5去盡染色液，用PBS洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體。洗滌時宜用搖床或手動晃動。

1.6滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，讓細(xì)胞接觸封片液，盡量避免氣泡。

1.7 熒光顯微鏡使用紫外激發(fā)，可檢測到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長350nm左右，發(fā)射波長460nm左右。

注：熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測。

二.懸浮細(xì)胞：

2.1 500 g（2400 rpm，下同）離心收集凋亡處理后細(xì)胞樣品于1.5 ml離心管內(nèi)，加入0.5 ml固定液，緩緩懸起細(xì)胞，常溫固定10分鐘或更長時間(可4℃過夜)。

2.2離心去盡固定液，用PBS洗兩遍，每次3分鐘，洗滌期間手動晃動數(shù)次。

2.3 細(xì)胞沉淀中加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，37℃避光染色10-15分鐘，手動晃動數(shù)次。

2.4 離心收集沉淀，重懸于100 μl PBS中。

2.5 取5 μl抗熒光淬滅封片液于載玻片上，加入等體積步驟2.4染色后細(xì)胞重懸液，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。

2.6 熒光顯微鏡下紫外激發(fā)，可檢測到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長350 nm左右，發(fā)射波長460 nm左右。

注：熒光染料都存在淬滅的問題，建議染色后盡快檢測。

三 實驗示例

操作流程：使用不同濃度星飽菌素（Staurosporine，STS）凋亡處理Jurkat細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁶/ml，每孔2 ml接種于六孔板中；加入終濃度為0，0.1，0.5，1，2，4 μM STS，37℃ 5%CO₂培養(yǎng)3小時；500 g 3 min收集細(xì)胞；細(xì)胞沉淀中加入1 ml固定液，常溫固定10 min；1×PBS漂洗兩次；細(xì)胞沉淀中加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，37℃避光染色10 min；離心后細(xì)胞沉淀重懸于100 μl 1×PBS中；取5 μl細(xì)胞懸液滴于載玻片上，加5 μl 抗熒光淬滅劑，封片觀察。