Hochest 33342活細(xì)胞染色液（100×）

Hoechst 33342 Staining Solution for Live Cells(100×)

●  產(chǎn)品組成：

● 產(chǎn)品簡介：

Hoechst 33342，也稱bisBenzimide H 33342 或HOE 33342，分子式為C₂₇H₂₈N₆O·3HCl ，分子量MW561.93，CAS: 23491-52-3，是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，對細(xì)胞的毒性較低。Hoechst 33342 專一性地與雙鏈DNA結(jié)合（優(yōu)先結(jié)合AT），常用于細(xì)胞核染色。染色后可以用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測。Hoechst 33342 的最大激發(fā)波長為346 nm（紫外激發(fā)），最大發(fā)射波長為460nm（藍(lán)色熒光）；Hoechst 33342 和雙鏈DNA 結(jié)合后，最大激發(fā)波長為350nm，最大發(fā)射波長為461nm。另外，由于Hoechst 33342專一性結(jié)合DNA，不與RNA結(jié)合，樣品無需使用RNase處理。與DAPI相比，Hoechst 33342具有更好的膜通透性，更適合于活細(xì)胞的染色。

Hoechst 33342和Hoechst 33258相比，Hoechst 33342對細(xì)胞的毒性作用更小一些，33258穿透能力較33342弱，染活細(xì)胞時容易被"泵出"，也就是拒染。所以一般來說Hoechst 33258用于細(xì)胞固定后再染色，而Hoechst33342則可以對活細(xì)胞直接進行染色。

本染色液為100×濃度，使用終濃度為1×，可直接用于活細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色，也可稀釋后用于固定細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色。

● 貯存：

-20℃避光保存，一年有效。

● 操作步驟：

一. 活細(xì)胞染色：

1.1 貼壁細(xì)胞：

1.1.1在培養(yǎng)液中均勻滴加適量的Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(100×)至終濃度為1×，輕柔混勻。例如對于十二孔板中培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞，每孔有1 ml的培養(yǎng)液，每孔需要加入10 μl Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(100×)。培養(yǎng)液中的血清、酚紅等都不會對染色產(chǎn)生干擾。

1.1.2在適宜于細(xì)胞培養(yǎng)的溫度孵育10分鐘，可以直接在熒光顯微鏡下觀察。如果考慮到培養(yǎng)液對觀察效果的影響，進行以下操作步驟。

1.1.3吸除含染料的培養(yǎng)液，用PBS洗滌2-3次即可在熒光顯微鏡下觀察。

注：為避免凋亡細(xì)胞隨培養(yǎng)液或PBS被吸除，在吸除液體前，對于用多孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞，最好用多孔板離心機離心一下以充分沉淀那些已經(jīng)漂浮起來的凋亡細(xì)胞。細(xì)胞發(fā)生凋亡時，會看到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。

1.2. 懸浮細(xì)胞：

1.2.1 在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入適量的Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(100×)至終濃度為1×，輕柔混勻。例如對于12孔板中培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞，每孔有1 ml的培養(yǎng)液，每孔需要加入10 μl Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(100×)。培養(yǎng)液中的血清、酚紅等都不會對染色產(chǎn)生干擾。

1.2.2 在適宜于細(xì)胞培養(yǎng)的溫度孵育10分鐘，可以直接在熒光顯微鏡下觀察。如果考慮到培養(yǎng)液對觀察效果的影響，進行以下操作步驟。

1.2.3將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，500 g 離心5分鐘收集細(xì)胞。細(xì)胞沉淀用PBS洗兩遍，每次3分鐘，吸盡液體。

1.2.4細(xì)胞沉淀中加入100-200 μl PBS，重懸沉淀。

1.2.6取5 μl抗熒光淬滅封片液于載玻片上，加入等體積步驟1.2.4染色后細(xì)胞重懸液，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。

1.2.6 熒光顯微鏡使用紫外激發(fā)，可檢測到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長350nm左右，發(fā)射波長460nm左右。

染色程序：

 Jurkat細(xì)胞密度調(diào)整到1×10⁶/ml，六孔板接種2 ml，加入10 μl STS（星孢菌素）至終濃度1 μM

 37度培養(yǎng)3小時；加入20 μl Hochest 33342活細(xì)胞染色液（100×），RT避光染色15分鐘，熒光顯微鏡直接觀察。左圖為正常細(xì)胞（10×），右圖為STS誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞（10×）。

染色程序：

 293細(xì)胞消化后調(diào)整密度為1×10⁵/ml；12孔板，每孔接種1 ml，37度培養(yǎng)30小時；加入10 μl Hochest 33342活細(xì)胞染色液（100×）；37度培養(yǎng)10分鐘，直接觀察。