1×MonoColor蛋白上樣緩沖液（單染料，變性，還原，無氣味）

● 產(chǎn)品簡介：

1×MonoColor蛋白上樣緩沖液(單染料，變性，還原，無氣味)是一種經(jīng)過改良的以溴酚藍為染料的蛋白上樣緩沖液。可以直接用于細(xì)胞或組織樣品的裂解，并用于后續(xù)常規(guī)的SDS-PAGE蛋白樣品的上樣。使用該產(chǎn)品直接裂解蛋白樣品的優(yōu)點是比較便捷；缺點是裂解好的蛋白樣品不能用常規(guī)的蛋白定量方法測定蛋白濃度，這樣蛋白上樣量的均一性就較難控制，需要借助考馬斯亮藍等的染色結(jié)果或Western的檢測結(jié)果，來調(diào)整上樣量。當(dāng)細(xì)胞量或組織用量能控制得比較均一時，使用本裂解液直接裂解獲取蛋白樣品會比較便捷。 

該產(chǎn)品使用了經(jīng)典還原劑DTT和巰基乙醇的替代物，無DTT和巰基乙醇的不愉快氣味，無毒，無刺激性氣味。

● 保存條件：

-20℃保存，開封后有效期1年。

●  使用方法：

1. 在常溫或不超過37℃的水浴中溶解上樣緩沖液(1×)。水浴溶解后立即常溫存放，盡量避免長時間置于水浴中。

2. 細(xì)胞樣品：

2.1 對于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。按照6 孔板每孔（細(xì)胞數(shù)量~2.5×10⁶）加入150-250微升上樣緩沖液(1×)的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使上樣緩沖液(1×)和細(xì)胞充分接觸。通常上樣緩沖液(1×)接觸細(xì)胞1-2秒后，細(xì)胞就會被裂解。裂解后的樣品收集到1.5 ml離心管內(nèi)。

2.2 對于懸浮細(xì)胞：450 g 4℃離心5分鐘收集細(xì)胞，棄上清，用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板（細(xì)胞數(shù)量~2.5×10⁶）每孔細(xì)胞加入150-250微升上樣緩沖液(1×)，再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。

3.組織樣品：

3.1 把組織剪切成細(xì)小的碎片。

3.2 按照每20毫克組織加入150-250微升上樣緩沖液(1×)的比例加入緩沖液。

注：如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的上樣緩沖液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少上樣緩沖液的用量。

3.3 用玻璃勻漿器勻漿或者用27#針頭抽打5-10次，直至充分裂解。

3.4 充分裂解后，將樣品收集到1.5 ml離心管內(nèi)。

注：如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈渦旋震蕩使樣品裂解充分。直接裂解的優(yōu)點是比較方便，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

4. 95-100℃加熱10分鐘，以充分變性蛋白。

注：加熱前通常會發(fā)現(xiàn)蛋白樣品內(nèi)有粘稠的半透明狀物體，通常在上樣緩沖液內(nèi)加熱8-10分鐘后該粘稠的半透明狀物體消失。如果起始時細(xì)胞或組織的用量較大，基因組DNA含量較高，加熱10分鐘后有可能仍然比較粘稠或者有粘稠狀的半透明物體。此時需要再煮沸10分鐘或者補加適量1×的上樣緩沖液后再煮沸5分鐘。充分煮沸后一方面可以使結(jié)合在基因組DNA上的蛋白充分釋放，同時會導(dǎo)致基因組DNA的部分?jǐn)嗔褟亩拐吵砀邢?，這樣就不會影響后續(xù)的上樣操作了。

5. 樣品冷卻到常溫后，12000 rpm離心2分鐘，上清即可直接上樣到SDS-PAGE凝膠加樣孔內(nèi)。通常電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。