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Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒(手灌膠)

Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒(手灌膠)

產(chǎn)品編號:RTD6140

產(chǎn)品規(guī)格:10次

數(shù)量
價格 ¥800

Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒(手灌膠)

   Blue/Clear Native PAGE Electrophoresis Kit  Ver.731072

貨號

名稱

包裝

RTD6140

Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒(手灌膠)

10

貨品內(nèi)容:

組份

貨號

名稱

規(guī)格

保存

1

RTD6140-01

2×BN/CN凝膠緩沖液

40 ml

4

2

AC2914-30ml

40% PAA29:1

30 ml

4

2

BC500P

10×BN/CN PAGE電泳緩沖液(干粉)

500 ml

RT

3

PL114-01

4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液

1 ml

-20

4

BC270

2% G-250染料(電泳用)

20 ml

RT

5

BC260-01

5% G-250染料(上樣用)

1 ml

4

6

SR0510

濃縮膠紅色添加染料(200×)

0.5 ml

RT

7

AP020P

APS(干粉)

0.5 g

RT(配制后-20℃貯存)

8

TA0761

TEMED

0.5 ml

4 避光

9

說明書

一份

產(chǎn)品簡介:

Blue/Clear Native PAGE(BN/CN-PAGE)是一種從生物樣品(質(zhì)膜,胞漿等)中分離分子量10 kD-10 M kD 范圍的蛋白質(zhì)復(fù)合物的電泳技術(shù)。其原理是用溫和去污劑(如 DDM,digitonin)將蛋白復(fù)合體從細胞膜中以近似天然的狀態(tài)分離出來,Blue Native PAGE (BN-PAGE)是用考馬斯亮藍 G-250 代替 SDS與蛋白結(jié)合而使其帶負電荷,根據(jù)蛋白分子量不同在 PAGE膠中得到分離;Clear Native PAGE(CN-PAGE)是電泳緩沖液中不加入任何染料,電泳中始終保持蛋白的天然電荷和活性狀態(tài),然而,其蛋白的分辨率要低于Blue Native PAGE。另外,BN-PAGE由于考馬斯亮藍G-250存在,使蛋白都覆蓋上負電荷,可以分離堿性蛋白(pI>7)和酸性蛋白(pI<7);而CN-PAGE只適合于酸性蛋白(pI<7)的分離。

本產(chǎn)品包括BN/CN-PAGE制膠的所有成分,方便使用??梢杂糜诜蛛x分子量在 10 kD-500 kD 的蛋白復(fù)合體,樣品可以來于胞漿、細胞總裂解液、細胞膜、線粒體膜和葉綠體膜等。電泳后可直接用于考染、銀染、Western 雜交、SDS-PAGE電泳、蛋白純化、蛋白活性檢測等分析實驗,也可直接用于電洗脫制備蛋白。

試劑盒配套有紅色濃縮膠添加染料,凝固后的濃縮膠為紅色,有利于在藍色電泳緩沖液中觀察加樣孔,方便上樣。

本試劑盒大約可以配制8-25塊常規(guī)大?。?×10 cm)PAGE凝膠,具體數(shù)量根據(jù)凝膠濃度和厚度決定,1 mm厚度8%凝膠可以配制至少10塊膠。

● 運輸和貯存:

本產(chǎn)品常溫運輸;組份按照標簽溫度貯存;有效期一年。

使用說明:

. 樣品制備:

   該試劑盒不含樣品制備的相關(guān)試劑,根據(jù)樣品種類,具體選擇不同提取方法。植物類囊體BN樣品制備可以選擇植物類囊體膜提取試劑盒(貨號:RTU5002);動物總蛋白BN樣品制備可以選擇動物胞漿活性蛋白提取試劑盒(不含去垢劑,離心柱法)(貨號:RTD8106);動物膜蛋白BN樣品制備可以選擇動物膜蛋白提取試劑盒(細胞)(貨號:RTD8111)和動物膜蛋白提取試劑盒(組織)(貨號:RTD8112);動物線粒體BN樣品制備可以選擇動物細胞線粒體提取試劑盒(貨號:RTD8115)和動物組織線粒體提取試劑盒(貨號:RTD8117)。

. 制膠:

2.1 分離膠制備:

2.1.1 不同濃度的分離膠的最佳分離范圍:

分離膠濃度

最佳分離范圍

6%

80-500 kD

8%

50-350 kD

10%

20-150 kD

12%

15-100 kD

15%

10-80 kD









2.1.2根據(jù)表一,將不同體積的成分在小燒杯中混合,輕輕攪拌使其混勻,避免產(chǎn)生氣泡

2.1.3在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液(對于mini-gel,凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可),然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-3 cm的水層,使凝膠表面保持平整。

2.1.4靜置15-30分鐘,待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個清晰的界面后,說明凝膠已聚合。

注:凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時,聚合較快;冬天氣溫低時,聚合時間會延長??梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。

表一 Blue/Clear Native PAGE分離膠配方表

(以一塊1.0 mm厚度mini膠為例)

分離膠總體積 5 ml

6%

8%

10%

12%

15%

組份

組份加入體積(ml

滅菌水

1.7

1.45

1.2

0.95

0.57

2×BN/CN凝膠緩沖液

2.5

2.5

2.5

2.5

2.5

40 PAA29:1

0.75

1

1.25

1.5

1.875

10 APS

0.05

0.05

0.05

0.05

0.05

TEMED

0.005

0.005

0.005

0.005

0.005

2.2 濃縮膠制備:

2.2.1去除覆蓋在分離膠上的水層。

2.2.2按照表二將不同成分在一個小燒杯中混合,輕輕攪拌使其混勻,避免產(chǎn)生氣泡。

2.2.3將濃縮膠溶液加至分離膠的上面,直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端。

2.2.4將梳子插入凝膠內(nèi),避免產(chǎn)生氣泡。

2.2.5靜置30-60分鐘,等待濃縮膠聚合。

注:凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時,聚合較快;冬天氣溫低時,聚合時間會延長??梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。

表二 Blue/Clear Native PAGE濃縮膠(4%)配方表(以一塊1.0mm厚度mini膠為例)

組份

不同凝膠體積對應(yīng)各組份的取樣量

濃縮膠總體積2 ml

H2O

0.8 ml

2×BN/CN凝膠緩沖液

1 ml

40 PAA29:1

0.2 ml

濃縮膠紅色添加染料(200×)

10 μl

10 APS

20 μl

TEMED

2 μl

. 電泳:

3.1 準備電泳緩沖液:

將10×BN/CN PAGE電泳緩沖液(干粉)溶于500 ml滅菌水中,徹底溶解,測定pH應(yīng)為7.0左右,不要調(diào)節(jié)pH。用前稀釋10倍即配成1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。

3.1.1 CN-PAGE電泳:

陽極緩沖液和陰極緩沖液均直接使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液進行電泳。

3.1.2 BN-PAGE電泳:

陽極緩沖液(外槽)使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液,陰極緩沖液(內(nèi)槽)按照下表配制:

 

1×藍色陰極緩沖液

 

150 ml

10×BN/CN PAGE電泳緩沖液

15 ml

2% G-250 染料(電泳用)

1.5   ml

超純水

定容至150 ml

3.2 準備樣品:

3.2.1 CN-PAGE電泳:

總體積

10 μl

蛋白樣品

x μl

4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液

2.5 μl

超純水

補至10 μl

 

不要加熱


3.2.2 BN-PAGE電泳:

3.2.2.1 植物類囊體膜蛋白電泳:

總體積

10 μl

 

含去垢劑樣品*

植物類囊體膜蛋白樣品

2%DDM增溶)

x μl

4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液

2.5 μl

5% G-250染料(蛋白上樣)

1 μl

超純水

補至10 μl

 

不要加熱

*植物類囊體膜蛋白電泳中,含去垢劑樣品中染料加入按照以下原則:

植物類囊體樣品中G250終濃度為去垢劑終濃度的1/4。例如樣品中DDM(n-Dodecyl β-D-maltoside,β-DM, n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷)終濃度為2%,則需要G-250終濃度為0.5%。10 μl蛋白樣品中需要加5% G-250染料1 μl。

3.2.2.2 動物線粒體BN樣品電泳:

總體積

10 μl

 

含去垢劑樣品*

動物線粒體BN樣品

1%DDM增溶)

x μl

4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液

2.5 μl

5% G-250染料(蛋白上樣)

0.25 μl

超純水

補至10 μl

 

不要加熱

*動物線粒體BN樣品電泳中,含去垢劑樣品中染料加入按照以下原則:

動物線粒體BN樣品中G250終濃度為去垢劑終濃度的1/8。例如樣品中DDM終濃度為1%,則需要G-250終濃度為0.125%。10 μl蛋白樣品中需要加5% G-250染料0.25 μl。

3.2.2.3 不含去垢劑樣品:

總體積

10 μl

不含去垢劑樣品

x μl

4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液

2.5 μl

5% G-250染料(蛋白上樣)

- #

超純水

補至10 μl

 

不要加熱

# 不含去垢劑樣品可以不必添加5%G-250染料。


3.3電泳過程;


3.3.1 CN-PAGE電泳:

電泳內(nèi)外槽均使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。在電泳槽的內(nèi)槽內(nèi)加入1×BN/CN PAGE電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過加樣孔),輕輕撥出預(yù)制膠梳子,用1ml吸頭沖洗加樣孔3次,隨后在電泳槽外槽加入適量的1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。

CN-PAGE電泳

恒電壓

起始電流

結(jié)束電流

電泳時間

120V

10-15mA/板膠

4-10mA/板膠

50+min

注:冰浴電泳

3.3.2 BN-PAGE電泳:

BN-PAGE電泳外槽使用1×BN/CN電泳緩沖液;內(nèi)槽開始電泳使用的是1×藍色陰極緩沖液,冰浴電泳,等待電泳指示前沿到達距離凝膠頂部2/3處時,將電泳緩沖液更換為1×BN/CN電泳緩沖液,繼續(xù)后續(xù)電泳,因為過多染料會影響蛋白在凝膠中的遷移以及蛋白后續(xù)的轉(zhuǎn)膜實驗。


BN-PAGE電泳條件(一板膠)

恒電壓

起始電流

電泳時間

緩沖液

 

120 V

8-15 mA

20-25 min

1×藍色陰極緩沖液

冰浴電泳


 指示前沿至凝膠頂部三分之二處,更換內(nèi)槽緩沖液為無色1×BN/CN 電泳緩沖液



恒電壓

繼續(xù)電泳時間

結(jié)束電流

緩沖液

 

120 V

45 min +

3-5 mA

1×BN/CN電泳緩沖液

冰浴電泳

. 轉(zhuǎn)膜:

BN-PAGE轉(zhuǎn)膜必須用PVDF膜,不能用NC膜,因為NC膜與G-250結(jié)合非常緊密。

轉(zhuǎn)膜緩沖液可以使用10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液(貨號:BC600P)。

. 染色:

5.1 將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中,加入適量FastBlue蛋白染色液(以剛剛覆蓋過膠面為適),條帶1-2分鐘即可見。

5.2 搖床常溫搖動10-15分鐘至條帶清晰可見。

5.3 加入適量蒸餾水脫色,期間更換1-2次蒸餾水,搖床常溫搖動10-15分鐘至背景干凈。

5.4 觀察保存結(jié)果。

六. 實驗示例:




                  RTD6140 Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒(手灌膠) WB檢測
樣品處理:K562懸浮細胞提取胞漿活性蛋白(貨號:RTD6106 動物活性蛋白提取試劑盒(不含去垢劑)) 
4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液(貨號:PL114) 調(diào)整蛋白濃度為1μg/μl上樣液,梯度上樣5-20μg
電泳:8% BN手灌膠,穩(wěn)壓200V 1×藍色陰極緩沖液至指示前沿距離膠上沿2/3處,
更換為無色1×BN/CN PAGE電泳緩沖液,電泳時間共83分鐘
轉(zhuǎn)膜:0.45 μm PVDF膜,10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液(貨號:BC600P)稀釋為1×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液加20%甲醇,
恒流200mA  2小時,未冰浴。
轉(zhuǎn)膜效果檢測:膜用麗春紅染色液染色(貨號:RTD6301)有可見條帶,膠用FastBlue蛋白染色液染色
(貨號:RTD6202)幾乎無條帶,證明轉(zhuǎn)膜成功。膜用無水甲醇清洗5分鐘去除膜上藍色殘余。
封閉:Western快速封閉液(貨號:WR5020)  RT  封閉10 分鐘;
一抗:兔單抗GAPDH 1:10000  RT 60min;二抗:羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min,
ECL檢測:RealECL發(fā)光液(貨號:EC2520),曝光1秒。

使用RTD6140 Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒(手灌膠)產(chǎn)品發(fā)表部分文章列表:

1. [2022 IF=2.9] Identification and structural analysis of dimeric chicken complement

component 3d and its binding with chicken complement receptor 2.

Author: Huan Jin, Min Tu, Zhaoying Meng, Bo Jiang, Qianqian Yang, Yongqing Li,Zhenhua Zhang

Journal: Developmental and Comparative Immunology 152 (2024) 105109 

Institution: Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences

Paper linkhttps://doi.org/10.1016/j.dci.2023.105109  


 
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