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EMSA PAGE凝膠配制試劑盒

EMSA PAGE凝膠配制試劑盒

產(chǎn)品編號(hào):RTE4104

產(chǎn)品規(guī)格:30-60次

數(shù)量
價(jià)格 ¥180

EMSA PAGE凝膠配制試劑盒  

PAGE Electrophoresis Kit for EMSA         

貨號(hào)

名稱

規(guī)格

RTE4104

EMSA PAGE凝膠配制試劑盒

30-60

產(chǎn)品組成:

貨號(hào)

名稱

規(guī)格

貯存

RTE4104-01

40%PAA(37.5:1)

50 ml

4,避光

RTE4104-02

5×TBE

50 ml

RT

RTE4104-03

80%甘油

20 ml

RT

AP020P

APS(干粉)

5 ml

RT配制后-20貯存

TA0761-01

TEMED

0.5 ml

4,避光

產(chǎn)品簡介:

EMSA PAGE凝膠配制試劑盒(PAGE Gel Preparation Kit for PAGE)提供了配制EMSA  PAGE凝膠所需的各種試劑,用戶只需自備制膠器具和蒸餾水,即可配制不同濃度的EMSA PAGE凝膠。凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(也稱凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)) (Electrophoretic mobility shift assay, EMSA),也稱Gel Shift,是一種用于研究蛋白與核酸相互作用的高靈敏實(shí)驗(yàn)技術(shù)。主要用于轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子相互作用的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn),也可應(yīng)用于蛋白與DNA、蛋白與RNA相互作用研究。EMSA技術(shù)基于進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳時(shí),蛋白質(zhì)與DNA或RNA復(fù)合物的遷移速度比游離線性DNA或RNA片段慢,從而導(dǎo)致DNA或RNA遷移位置在與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)滯后。

本試劑盒大約可以配制30-50塊常規(guī)大小(8×10 cm)PAGE凝膠,具體數(shù)量根據(jù)凝膠厚度決定:0.75mm厚度凝膠可以配制60塊膠,1 mm厚度凝膠可以配制45塊膠,1.5 mm厚度凝膠可以配制30塊膠。

貯存和效期:

   本產(chǎn)品常溫運(yùn)輸;按照標(biāo)簽溫度貯存;有效期一年。

使用說明:

10% APS配制-5 ml

將0.5 gAPS干粉溶于5 ml滅菌水中,徹底溶解后分裝,1 ml/支,-20℃?zhèn)浯?,每次取一管使用?0% APS應(yīng)盡量減少常溫存放時(shí)間,以防失效,若發(fā)現(xiàn)凝膠聚合時(shí)間延長,應(yīng)考慮更換使用-20度保存的10% APS。

一、制備凝膠步驟:

1.1 參照凝膠模具說明書,裝配好凝膠模具。

1.2按照表格將不同體積的成分在小燒杯中混合;最后加入10%APS和TEMED,輕輕攪拌使其混勻,避免產(chǎn)生氣泡。配制一塊常用EMSA PAGE膠(8×10 cm)所需凝膠溶液體積:0.75 mm厚度凝膠約5 ml;1 mm厚度凝膠約7 ml;1.5 mm厚度凝膠約10 ml。均含約0.5 ml的余量。

EMSA PAGE凝膠配方表一 (0.75 m厚度凝膠)

總體積5 ml,適用于厚度0.75 mm小板膠

各組份體積(ml

膠濃度

滅菌水

40%PAA(37.5:1)

80%甘油

5×TBE

10%APS

TEMED

4%

3.8

0.5

0.156

0.5

0.05

0.005

5%

3.66

0.625

0.156

0.5

0.05

0.005

6%

3.54

0.75

0.156

0.5

0.05

0.005


EMSA PAGE凝膠配方表二 (1.0 mm厚度凝膠)

總體積7 ml,適用于厚度1 mm小板膠

各組份體積(ml

膠濃度

滅菌水

40%PAA(37.5:1)

80%甘油

5×TBE

10%APS

TEMED

4%

5.3

0.7

0.22

0.7

0.07

0.007

5%

5.2

0.875

0.22

0.7

0.07

0.007

6%

5.0

1.05

0.22

0.7

0.07

0.007


EMSA PAGE凝膠配方表三 (1.5 mm厚度凝膠)

總體積10 ml,適用于厚度1.5 mm小板膠

各組份體積(ml

膠濃度

滅菌水

40%PAA(37.5:1)

80%甘油

5×TBE

10%APS

TEMED

4%

7.6

1

0.313

1

0.1

0.01

5%

7.4

1.25

0.313

1

0.1

0.01

6%

7.1

1.5

0.313

1

0.1

0.01

1.3在玻璃板中灌入凝膠溶液至玻璃板頂端,插入梳子,避免產(chǎn)生氣泡。

1.4靜置20-60分鐘,等待凝膠完全聚合。

環(huán)境溫度

凝固時(shí)間

低于18

60分鐘

18

~40分鐘

25

~30分鐘

高于25

~20分鐘

注:凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí),聚合較快;冬天氣溫低時(shí),聚合時(shí)間會(huì)延長??梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。

二、電泳:

2.1預(yù)電泳:拔出梳子,用0.5×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次。電泳槽內(nèi)外加入適量0.5×TBE緩沖液,穩(wěn)壓100 V預(yù)電泳10分鐘。

注:試劑盒配套的5×TBE緩沖液僅夠配制凝膠用,0.5×TBE電泳緩沖液請(qǐng)自己制備,配方如下:

終濃度

順序

原料

1

5

44.5 mM

1

Tris [MW121.14]

5.4

27

1 mM

2

EDTA 2Na·2H2O [MW372.24]

0.372

1.86

44.5 MM

3

硼酸 [MW61.83]

2.75

13.75

 

4

超純水最后定容至

1

5

 

 

最后pH8.2-8.3之間,可以不用調(diào)節(jié)pH,記錄每批pH

2.2 把混合了無色上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個(gè)上樣孔內(nèi)加入10 μl稀釋好的1X的EMSA 上樣緩沖液(藍(lán)色),用于觀察電泳進(jìn)行的情況。

2.3 穩(wěn)壓100 V電泳,可以冰浴或4度條件下電泳,確保膠的溫度不超過30℃。電泳至上樣緩沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處,停止電泳。


 
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