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單鏈DNA Marker(20-75 nt)

單鏈DNA Marker(20-75 nt)

產(chǎn)品編號(hào):RTM507

產(chǎn)品規(guī)格:25次

數(shù)量
價(jià)格 ¥500

單鏈DNA Marker20-75 nt                      

 

貨號(hào)

名稱(chēng)

規(guī)格

RTM507

單鏈DNA Marker20-75 nt

25

● 產(chǎn)品編號(hào)及規(guī)格:

貨號(hào)

名稱(chēng)

規(guī)格

貯存

RTM507-01

單鏈DNA Marker20-75 nt

62.5 μl

-20℃

DL080-01

2×TBE尿素上樣緩沖液

1 ml

4

DL112-01

非變性PAGE DNA上樣緩沖液

1 ml

4

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介:

單鏈DNA Marker由不同長(zhǎng)度的單鏈DNA分子混合而成,7條帶的大小為20,25,30,35,40, 50,75 nt。該產(chǎn)品不含有上樣緩沖液,可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求使用不同的上樣緩沖液,用于尿素變性電泳或非變性電泳。電泳后的PAGE膠可以使用單鏈DNA PAGE電泳染色試劑盒(Cat:RTS5103),核酸PAGE電泳染色試劑盒(Cat:RTS5102),核酸快速高靈敏度染色試劑盒(Cat:RTS5101)或核酸染料如RealSafe Red(貨號(hào):GR002)或RealSafe All(貨號(hào):GR004)進(jìn)行染色,均可以得到清晰的條帶分離效果。

產(chǎn)品附帶2×TBE尿素上樣緩沖液和2×非變性PAGE DNA上樣緩沖液,方便待檢樣品的上樣。

配制好的即用型單鏈DNA Marker以每次上樣5 μl計(jì)算,該產(chǎn)品可以使用大約25次。

●  保存條件和運(yùn)輸:

按照標(biāo)簽溫度貯存;有效期2年;濕冰運(yùn)輸。

● 使用方法:

. 即用型單鏈DNA Marker20-75 nt)配制方法:

1.1 進(jìn)行尿素變性電泳:

即用型單鏈DNA Marker20-75 nt

配制體積 20 μl

DNA Marker20-75 nt

10 μl

2×TBE尿素上樣緩沖液

10 μl

 

混勻,70℃處理5分鐘

1.2 進(jìn)行非變性電泳:

即用型單鏈DNA Marker20-75 nt

配制體積 20 μl

DNA Marker20-75 nt

10 μl

非變性PAGE DNA上樣緩沖液

10 μl

 

混勻,不用加熱處理

. 凝膠制備:

注:以下使用方法均以8×10cm凝膠 厚1.0mm示例,其他規(guī)格凝膠請(qǐng)適當(dāng)調(diào)整。

2.1 TBE-尿素凝膠制備:

2.1.1 可以選擇DNA尿素PAGE電泳試劑盒(Cat:RTE4102))或按照以下程序制膠:

表一 TBE-尿素PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml,適用于厚度1.0 mm小板膠)

單鏈DNA長(zhǎng)度

最佳凝膠濃度

尿素(克)

40%PAA

29:1

10×TBE

補(bǔ)水到總體積

10%APS

TEMED

200-1000 nt

5%

2.1

0.625 ml

0.5 ml

5 ml

50 μl

5 μl

50-400 nt

8%

2.1

1 ml

0.5 ml

5 ml

50 μl

5 μl

30-300 nt

10%

2.1

1.25 ml

0.5 ml

5 ml

50 μl

5 μl

10-150 nt

15%

2.1

1.875 ml

0.5 ml

5 ml

50 μl

5 μl

5-120 nt

20%

2.1

2.5 ml

0.5 ml

5 ml

50 μl

5 μl

2.1.2在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液(對(duì)于mini-gel,凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可),然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5 cm的水層,使凝膠表面保持平整。

2.1.3靜置10-20分鐘,待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面后,說(shuō)明凝膠已聚合。

注:凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí),聚合較快;冬天氣溫低時(shí),聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)??梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。

2.1.4去除覆蓋在分離膠上的水層;按照表二將不同體積成分在一個(gè)小燒杯中混合;最后加入10%過(guò)硫酸銨和TEMED,輕輕攪拌使其混勻,避免產(chǎn)生氣泡。

表二 TBE-尿素PAGE 4%濃縮配方表 (總體積2 ml,適用于1.0mm厚度膠)

各組份體積(ml

凝膠濃度

尿素

40%PAA29:1

10×TBE

滅菌水

10%APS

TEMED

4%

0.84

0.2 ml

0.2 ml

補(bǔ)水至體積2 ml

20 μl

2 μl

2.1.5將濃縮膠溶液加至分離膠的上面,直至凝膠溶液到達(dá)前玻璃板的頂端;將梳子插入凝膠內(nèi),避免產(chǎn)生氣泡。

2.1.6靜置30-60分鐘,等待濃縮膠聚合。

注:凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí),聚合較快;冬天氣溫低時(shí),聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)。可以根據(jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。

2.2非變性凝膠制備:

2.2.1可以選擇DNA非變性PAGE電泳試劑盒(貨號(hào):RTE4101)或按照以下程序制膠。

2.2.2按照表三將不同體積的成分在小燒杯或試管中混合;最后加入10%APS和TEMED,輕輕攪拌使其混勻,避免產(chǎn)生氣泡。

2.2.3在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液(對(duì)于mini-gel,凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可),然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5 cm的水層,使凝膠表面保持平整。

2.2.4靜置10-20分鐘,待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面后,說(shuō)明凝膠已聚合

表三 TBE-非變性PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml,適用于厚度1.0 mm小板膠)

各組份體積(ml

最佳DNA分離范圍

凝膠濃度

滅菌水

30%PAA291

5×TBE

10%APS

TEMED

70-450 bp

6%

3

1.0

1.0

0.05

0.005

60-460 bp

8%

2.66

1.34

1.0

0.05

0.005

50-300 bp

10%

2.33

1.67

1.0

0.05

0.005

40-200 bp

12%

2

2.0

1.0

0.05

0.005

25-150 bp

15%

1.5

2.5

1.0

0.05

0.005

5-100 bp

20%

0.66

3.34

1.0

0.05

0.005

注:凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí),聚合較快;冬天氣溫低時(shí),聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)??梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。

2.2.5去除覆蓋在分離膠上的水層;按照表四將不同體積成分在一個(gè)小燒杯或試管中混合;最后加入10%過(guò)硫酸銨和TEMED,輕輕攪拌使其混勻,避免產(chǎn)生氣泡。

表四 TBE-非變性PAGE 4%濃縮配方表 (總體積1.5 ml,適用于1.0mm厚度膠)

各組份體積(ml

凝膠濃度

滅菌水

30%PAA291

5×TBE

10%APS

TEMED

4%

1.0

0.2

0.3

0.02

0.002

2.2.6將濃縮膠溶液加至分離膠的上面,直至凝膠溶液到達(dá)前玻璃板的頂端;將梳子插入凝膠內(nèi),避免產(chǎn)生氣泡。

2.2.7靜置30-60分鐘,等待濃縮膠聚合。

注:凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí),聚合較快;冬天氣溫低時(shí),聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)??梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。

. 樣品制備:

3.1 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?,配制即用型單鏈DNA Marker樣品(步驟一)。單鏈DNA樣品使用尿素變性電泳,雙鏈DNA樣品使用非變性電泳,單鏈/雙鏈混合樣品使用非變性電泳。

. 電泳:

4.1. 預(yù)電泳(可選):電泳槽內(nèi)外加入適量1×TBE緩沖液穩(wěn)壓200V預(yù)電泳30分鐘。電泳結(jié)束后,1×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3。

4.2.上樣:根據(jù)梳齒確定Marker上樣量, 一般是10齒1mm厚梳子上樣5 μl,15齒1mm厚梳子上樣3 μl。

4.3. 連接電源線(xiàn),打開(kāi)電源開(kāi)關(guān),按照以下條件電泳。

 

恒電壓

起始電流

結(jié)束電流

電泳時(shí)間

適用條件

推薦電壓

200 V

15-20 mA/板膠

10-15 mA/板膠

60+ min

最佳電壓,最優(yōu)的分辨率

4.4. 等待上樣緩沖液的溴酚藍(lán)指示前沿到凝膠底部時(shí)終止電泳,取出凝膠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

膠濃度

溴酚藍(lán)

二甲苯菁

5%

~35 nt

~130 nt

8%

~19 nt

~75 nt

10%

~15 nt

~55 nt

15%

~10 nt

~52 nt

20%

~8 nt

~35 nt

五.染色:

用單鏈DNA PAGE電泳染色試劑盒(Cat:RTS5103),核酸PAGE電泳染色試劑盒(Cat:RTS5102)或核酸快速高靈敏度染色試劑盒(Cat:RTS5101)染色均可以得到清晰的條帶分離效果。注:如果使用核酸染料染色,RealSafe Red(貨號(hào):GR002)或RealSafe All(貨號(hào):GR004)核酸染料結(jié)合單鏈核酸效果最佳,強(qiáng)烈建議使用以便獲得最佳效果的膠圖。其余染料如GelRed,Goldview,EB等染色效果不好。

 
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