RNA提取試劑（目錄號(hào)：RTR2301）
● 試劑內(nèi)容：
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名稱
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RTR2301
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RNA提取試劑
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100ml
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說明書
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1份
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● 儲(chǔ)存、運(yùn)輸及效期：
2-8℃避光保存；常溫運(yùn)輸；有效期1年。
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
RNA提取試劑是從細(xì)胞和組織中提取總RNA的即用型試劑，可以提取細(xì)菌、植物、動(dòng)物組織和細(xì)胞以及新鮮血液的總RNA。提取的總RNA可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保護(hù)分析等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
● 產(chǎn)品特點(diǎn)：
1 分相明顯：本試劑為粉紅色，便于氯仿分相后區(qū)分水相和有機(jī)相。
2 結(jié)果可靠：該試劑含有強(qiáng)烈抑制RNase活性的物質(zhì)，可靠保護(hù)RNA不降解。
3 價(jià)廉物美：其提取效果與國外進(jìn)口產(chǎn)品相媲美，價(jià)格卻低于它的三分之一。
● 操作步驟：
實(shí)驗(yàn)前需要準(zhǔn)備的試劑和耗材：
氯仿、異丙醇、75%乙醇（用RNase-free水配制）、RNase-free的水、RNase-free的耗材（Tip頭，離心管等）。
1. 勻漿處理（Homogenization）
1.1組織中提取總RNA：
1.1.1植物組織：植物葉片直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100mg植物葉片加入1ml RNA提取試劑。
1.1.2動(dòng)物組織：按10-30mg組織加入1ml RNA提取試劑，用電動(dòng)勻漿器或者一次性研磨杵充分勻漿。
1.2 培養(yǎng)細(xì)胞中提取總RNA：
1.2.1貼壁細(xì)胞：無須胰酶消化，可直接用RNA提取試劑進(jìn)行裂解，每10cm2培養(yǎng)面積加1ml RNA提取試劑。
1.2.2懸浮細(xì)胞：可直接離心收集、裂解，每1ml RNA提取試劑可裂解5×106動(dòng)物或酵母細(xì)胞，或107細(xì)菌細(xì)胞。
1.3 血液中提取總RNA：
直接取新鮮的血液，加入3倍體積紅細(xì)胞裂解液，混勻后常溫放置10分鐘，9,000 g離心1分鐘。徹底吸棄上清，收集白細(xì)胞沉淀。每100-200μl血液收集的白細(xì)胞沉淀加入1ml RNA提取試劑。
2．分層（Phase Separation）
根據(jù)樣品，選擇使用方法2.1或者方法 2.2。如果不確定，則使用方法2.2。
2.1 (細(xì)胞，血液，一般動(dòng)物組織) – 常溫靜置 5 分鐘，再按照 1 ml RNA提取試劑 使用 200 μl 的比例加入氯仿，用力顛倒離心管以混勻；常溫靜置 3 -5 分鐘使之分層后，4℃12,000g離心 15 分鐘。
2.2 (植物，脂肪及肝臟等某些雜質(zhì)含量較高的樣品) – 常溫靜置 5 分鐘后，4℃12,000 g離心 10 分鐘，將上清移入另外一個(gè)離心管中。再按照 1 ml RNA提取試劑使用 200 μl 的比例加入氯仿，用力顛倒離心管以混勻。常溫靜置 2 - 5 分鐘使之分層后，4℃12,000 g離心 15 分鐘。
注：4℃ 離心對(duì)于降低基因組 DNA 的污染是很重要的。
雜質(zhì)含量高的樣品一定要使用 2.2 操作。該操作不僅可以將大部分雜質(zhì)離心去除，也可以將大片段的基因組 DNA 離心去除，方便加入氯仿后的分層，不過，如果想同時(shí)抽提總 RNA 和基因組 DNA，則使用 2.1操作。
加入氯仿后的混勻是非常重要的，否則靜止分相易出現(xiàn)分相倒置，即水相在離心管下部而有機(jī)相在上部。不推薦振蕩混勻，而推薦直接用手混勻：將管底斜向朝上，手斜向快速搖動(dòng)，使體系成粉色乳狀。
3．RNA沉淀（RNA
Precipitation）
小心將上層水相（通常可吸取550 μl）移至另外一個(gè)離心管中，再加入等體積冰冷的異丙醇混勻，常溫放置10 - 20 分鐘，4℃12000g離心10min，棄上清，RNA沉淀于管底。
注：
中間層和紅色下層置于4℃保存，以便接下去抽提基因組 DNA。
用冰冷的異丙醇能更迅速的沉降RNA。
取上層水相時(shí)要特別小心，絕對(duì)不要吸入白色中間層及紅色下層。移取水相時(shí)要使用小體積移液器：200 μl 移液器，吸頭的尖
嘴要貼在管壁，慢慢松手吸出液體。
對(duì)于脂肪類組織，包括腦組織，在上清的最上層為脂肪，取上清時(shí)不要吸入，必要時(shí)用等體積氯仿對(duì)上清再抽提一次。
棄上清后，將離心管置于離心機(jī)中快甩離心數(shù)秒，再用移液器將殘留液體小心吸出。這是最徹底的去除上清的方法，比倒掉上清后再將離心管倒扣在吸水紙上的方法可靠得多。如果是雜質(zhì)含量高的樣品，強(qiáng)烈建議增加此步操作。
4．RNA漂洗（RNA Wash）
4.1 RNA沉淀中加入1ml 75%乙醇（用RNase-free水配制），溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。每1ml RNA提取試劑加入1ml 75％乙醇。
4.2 4℃7,500 g離心5min，棄上清。
注：轉(zhuǎn)速不要高于7,500g，否則得到的RNA不易溶解。
4.3短暫快速離心，用移液器小心吸棄上清，注意不要吸棄沉淀。常溫放置1-2分鐘晾干沉淀。
注：RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。
5. 溶解RNA（Redissolving the RNA）
根據(jù)需要，沉淀中加入適量（一般可加50-100μl）RNase-free水，輕彈管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存。
實(shí)驗(yàn)示例：
1.2%瓊脂糖膠 1×TAE 150V 25min RealSafe Red預(yù)染
RNA提取試劑提取步驟：K562懸浮細(xì)胞，1 ml收集（6×106/ml），PBS漂洗兩遍，加入1 ml RNA提取試劑，懸浮后常溫靜置10分鐘，加入氯仿或氯仿替代物200 μl，徹底混勻后靜置10分鐘，自然分相，4度 13000 rpm 離心15分鐘，上清中加入等體積異丙醇，常溫靜置20分鐘，4度 13000 rpm離心15分鐘，沉淀用1 ml 75%乙醇漂洗，4度 8000rpm 離心2分鐘，沉淀溶于50μl RNase-free水中。
RTR2306操作簡(jiǎn)述如下：K562懸浮細(xì)胞，1ml收集（6×106/ml），PBS漂洗兩遍（平行做2管）。沉淀中加入350 μl 裂解液RL（已加β-ME），常溫裂解5分鐘，裂解物加到DNA清除柱CS中，離心收集到2 ml離心管中，離心管中加入0.5倍體積無水乙醇，全部溶液加到RNA吸附柱CR中，離心，隨后清除柱CS和RNA吸附柱CR一次RD漂洗，2次RW漂洗，最后每個(gè)吸附柱用50 μl RNase-free水洗脫，合并兩管得到100 μl RNA和100 μl去除的基因組DNA。