RealPure普通植物RNA提取試劑盒

RealPure Plant RNA Extraction Kit for Conventional Plants

● 試劑盒內(nèi)容及保存：

● 儲存條件和效期：

RNase-free水4℃保存；其他試劑在常溫（25℃左右）干燥條件下，可保存1年。試劑盒常溫運(yùn)輸。

● 產(chǎn)品簡介：

本試劑盒可從普通植物（擬南芥，水稻，小麥，煙草，玉米，綠蘿等）葉片、莖、幼苗、果肉中快速提取總RNA，可同時(shí)處理大量不同樣品，20-30分鐘內(nèi)即可完成反應(yīng)，提取的總RNA純度高，沒有DNA和蛋白的污染，可用于Northern blot、Dot blot、polyA 篩選、體外翻譯、RNase 保護(hù)分析和分子克隆等實(shí)驗(yàn)。

由于植物材料的復(fù)雜性，該試劑盒不能提取多糖多酚植物RNA，也不能有效提取植物種子、塊莖、鱗莖的RNA，提取這些材料的RNA請選擇RealPure多糖多酚植物RNA提取試劑盒（Cat：RTR2304）和RealPure植物種子RNA提取試劑盒（Cat：RTR2308）。

● 準(zhǔn)備工作：

1操作前在裂解液RL中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如500 μl RL中加入5 μl β-巰基乙醇。此裂解液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的 RL4 ℃可放置3天。

2 按照標(biāo)簽所示在漂洗液RW中加入無水乙醇（自備），混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存?zhèn)溆谩?

3 所有離心步驟均在常溫下進(jìn)行。

● 操作步驟：

1. 樣品處理:

1.1 1.5 ml離心管中加入500 μl裂解液RL（使用前請先檢查是否已加入β-巰基乙醇）。

注：多糖多酚植物（如銀杏，毛白楊等）使用該試劑盒不能提取RNA，請選擇RealPure多糖多酚植物RNA提取試劑盒（Cat：RTR2304）。

背景知識：快速判斷是否為多糖多酚植物

取20mg左右的植物材料，放入1.5 ml離心管中，加入0.5 ml 0.2 M NaOH溶液，95℃ 10分鐘，觀察裂解物顏色。顏色為綠色或淡黃色為普通植物；顏色為棕黃色或棕紅色為多糖多酚植物。

1.2將植物材料加入到液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀。取50 mg粉末迅速加入到離心管中，渦旋劇烈震蕩混勻，常溫放置5分鐘。

注：一定不要加入超過50 mg的粉末，否則樣品超過裂解液RL的裂解能力會導(dǎo)致RNA提取失敗。

背景知識：樣品處理量絕對不要超過RNA吸附柱處理能力，否則造成RNA殘留或者產(chǎn)量降低。不同植物組織種類RNA相差極大，例如有些植物種子RNA含量較高，玉米種子RNA含量可達(dá)50 μg/50 mg種子，超過50 mg材料會超過吸附柱吸附能力，導(dǎo)致提取失敗。所以開始摸索實(shí)驗(yàn)條件時(shí)，如果不清楚樣品RNA含量時(shí)寧可使用較少的樣品處理量，如植物組織不超過50 mg，隨后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果增加或者減少處理量。

2. 離心取上清：

13,000 rpm離心5 min，小心吸取收集管中的上清至1.5 ml RNase-free的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細(xì)胞碎片沉淀。一般可獲得400 μl上清。

3. 去除基因組污染：

上清中加入0.5倍體積的無水乙醇（如400 μl上清中加入200 μl無水乙醇），混勻（此時(shí)可能會出現(xiàn)沉淀），得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入DNA清除柱CS（清除柱放入收集管中）中，13,000 rpm離心2分鐘，棄掉收集管中的廢液。

注：確保全部溶液都收集到收集管中，如果膜上有殘留液體，延長離心時(shí)間至5分鐘，保證膜上無殘留液體。

4. 洗脫RNA：

  將DNA清除柱放入一干凈的2 ml離心管中，在清除柱中加入500 μl 裂解液RL plus，13,000 rpm離心1分鐘，收集濾液（注意：RNA在濾液中，不要丟棄），濾液中加入250 μl無水乙醇，此時(shí)可能會出現(xiàn)沉淀，立即混勻，不要離心。

5. RNA掛柱：

  將全部溶液加入到RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中），13,000 rpm離心2分鐘。

注：確保溶液全部過濾到收集管中，膜上無殘留，如有必要，可以延長離心時(shí)間至5分鐘。

6. 去除RNA中的蛋白污染：

向RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl 去蛋白液RD，13,000 rpm離心1分鐘，棄廢液。

7. 去除RNA中的其他雜質(zhì)：

向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW（使用前請先檢查是否已加入乙醇）， 13,000 rpm離心1分鐘，棄廢液。

8. 進(jìn)一步去除RNA中的其他雜質(zhì)：

向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW （使用前請先檢查是否已加入乙醇），13,000 rpm離心1

分鐘，棄廢液，將吸附柱CR放回收集管中，確保蓋好吸附柱管蓋。

9.  關(guān)鍵步驟：徹底去除吸附柱上的殘余乙醇：

13,000 rpm將吸附柱CR空甩離心2 分鐘，去除吸附柱上的殘余液體。

注：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，如果有漂洗液殘留，可能會影響后續(xù)的RT等實(shí)驗(yàn)操作。

10. 洗脫得到RNA：

將RNA吸附柱CR轉(zhuǎn)入一個(gè)新的1.5 ml RNase-free離心管中，向吸附柱O型墊圈中央懸空加入50-100 μl RNase-free水（事先65℃預(yù)熱可提高洗脫效率），蓋好吸附柱管蓋，常溫放置2分鐘，13,000 rpm離心2 分鐘。

注：確保水要加到膜的中央，不要貼壁加入；洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50 μl，體積過小影響回收效率。

11. RNA貯存：

RNA樣品-80℃中保存。

● RNA產(chǎn)量和質(zhì)量的評估：

1. RNA產(chǎn)量：

用分光光度計(jì)測定OD₂₆₀的吸光值來計(jì)算RNA產(chǎn)量。將RNA按照一定的比例稀釋于TE溶液（10mMTris pH8.0，1mMEDTA）中，根據(jù)以下公式計(jì)算：

A₂₆₀×稀釋倍數(shù)×40=μg RNA/ml

注：測定OD值時(shí)，盡量不要用RNase-free水稀釋RNA，因?yàn)镽Nase-free水pH較低，測定的OD值偏低。

2. RNA質(zhì)量：

凝膠電泳檢測：凝膠電泳中，完整的RNA應(yīng)該有兩條主帶：28S和18S，并且28S亮度應(yīng)該與18S相當(dāng)或是其亮度的2倍?？梢允褂闷胀ǖ?×TAE瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度1-1.5 %，可以使用高電壓，短時(shí)間電泳，如7V/cm電泳，20分鐘。建議使用D2000 DNA ladder（Cat：RTM415）作為Marker。植物28S rRNA遷移率與1500bp類似，18S rRNA遷移率與1000bp類似。

吸光值檢測：可以用A₂₃₀，A₂₆₀和A₂₈₀的數(shù)值表示RNA的純度。純凈的RNA的 A₂₆₀/A₂₈₀比值應(yīng)該為2，我們得到的RNA樣品比值應(yīng)在1.8-2.2之間，如果比值低于1.8，表明RNA樣品中蛋白污染比較嚴(yán)重。A₂₆₀/A₂₃₀比值應(yīng)該在2-2.2之間。如果此比值低于2，表明RNA樣品中有胍鹽，多糖的污染。

●  實(shí)驗(yàn)示例:

 ●  問題指南:

1. 離心柱發(fā)生堵塞

離心柱發(fā)生堵塞之后會造成 RNA 得率降低甚至不能純化得到 RNA。

常見原因分析如下：

1.1：樣本破碎不徹底。

樣本破碎不徹底會使吸附柱發(fā)生堵塞，同時(shí)會影響 RNA 得率及質(zhì)量。我們建議在進(jìn)行樣本破碎的時(shí)候，在足量的液氮中快速研磨操作，盡量破碎樣本細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等組織。

1.2 樣本初始量過多。

樣本使用量過多會導(dǎo)致裂解液RL或裂解液RSL裂解細(xì)胞時(shí)不完全，導(dǎo)致離心柱堵塞。RealPure植物RNA提取試劑盒處理樣本的初始最大量為50 mg。

1.3 離心機(jī)的溫度過低。

整個(gè) RNA 分離純化除了液氮破碎樣本組織外，所有的步驟均在常溫（20-25℃）進(jìn)行。有些低溫離心機(jī)的溫度低于 20℃，可能會造成離心柱的堵塞。如果發(fā)生這種現(xiàn)象，請將離心機(jī)溫度設(shè)置到 20-25℃。

2. 提取不到RNA或者RNA產(chǎn)量低

通常會有多種因素影響回收效率，比如：樣本 RNA 含量、操作方法、洗脫體積等。

常見原因分析：

2.1  樣本保存不當(dāng)或樣本保存時(shí)間過久導(dǎo)致RNA 已經(jīng)降解。

建議：新采集的樣本應(yīng)立即放入液氮中速凍，長期保存于-70℃并避免樣本的反復(fù)凍融；或者將樣本立即浸泡在 RNA 穩(wěn)定劑RNAwait溶液中。

2.2  樣本破碎裂解不充分導(dǎo)致純化柱堵塞。

建議：在組織研磨時(shí)，請保證組織充分研磨，并在研磨完成后迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)先準(zhǔn)備好的裂解液RL或裂解液RSL（確認(rèn)已添加正確比例的 β-ME）中。

2.3  洗脫液添加不正確。

建議：確認(rèn) RNase-Free 水滴加到了純化柱膜O型墊圈中央位置。

2.4  漂洗液RW中沒有添加正確體積的無水乙醇。

建議：請按照說明書，在試劑盒使用前，漂洗液RW中添加正確體積的無水乙醇并混勻。

2.5  組織樣本用量不合適。

建議：每 500 μl 裂解液RL或裂解液 RSL使用最大組織量50 mg，組織使用過多會導(dǎo)致 RNA 提取量降低并且得到的 RNA 純度也會降低。我們強(qiáng)烈建議每單次 RNA提取操作，樣本初始用量一定不要超過最大建議量。

2.6  洗脫體積不合適或洗脫不徹底。

建議：純化柱的洗脫液體積為 50-100 μl；若洗脫效果并不理想，建議在加入65℃預(yù)熱的RNase-Free 水后，延長常溫放置的時(shí)間，例如放置 5-10 min。

2.7  純化柱在第二次RW洗滌之后有乙醇?xì)埩簟?

建議：漂洗液RW洗滌后，吸附柱空甩離心2 min是關(guān)鍵步驟，以充分除去吸附柱上殘留的乙醇。

2.8  試劑盒使用不正確。

建議：對于多酚多糖的植物樣本，務(wù)必使用緩沖液PRS，這是我們專門針對多酚多糖植物樣本而研制的多糖多酚去除劑，如不添加，將導(dǎo)致RNA不能掛柱或提取到純度不高的RNA。

3. 純化獲得的RNA有降解

純化得到的 RNA 的質(zhì)量和樣本的保存、RNase 污染、操作等因素有關(guān)。

常見原因分析：

3.1  組織樣本采集后沒有及時(shí)保存。

建議：組織樣本在收集后若不及時(shí)使用，請立即低溫保存于液氮中或經(jīng)液氮速凍后立即轉(zhuǎn)移至-70℃長期保存，或者將樣本立即浸泡在 RNA 穩(wěn)定劑 RNAwait溶液中。提取 RNA 請盡量使用新近采取的組織樣本。

3.2  組織樣本反復(fù)凍融。

建議：組織樣本保存時(shí)，最好剪成小段保存，使用時(shí)取出其中一部分即可，避免樣本的反復(fù)凍融導(dǎo)致 RNA 的降解。

3.3  操作間有 RNase 引入或沒有佩戴一次性手套、口罩等。

建議：RNA 提取實(shí)驗(yàn)最好在單獨(dú)的 RNA 操作間進(jìn)行，并在實(shí)驗(yàn)前清理好實(shí)驗(yàn)桌，實(shí)驗(yàn)時(shí)佩戴一次性手套、口罩，最大程度上避免 RNase 引入導(dǎo)致的RNA 降解。

3.4  試劑在使用過程中被 RNase 污染。

建議：更換新的植物總RNA 提取系列試劑盒進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

3.5  RNA 操作時(shí)所用的離心管、槍頭等有 RNase 污染。

建議：確認(rèn) RNA 提取時(shí)所用到的離心管、槍頭、移液器等都是 RNase-Free。

4. RNA中含有DNA污染

4.1 提取的起始材料超過50 mg

建議：步驟1-樣品處理時(shí)用天平稱取粉末重量，不要超過50 mg，否則樣品的核酸量會超過DNA清除柱CS的處理極限，導(dǎo)致洗脫下的RNA有基因組DNA的污染。

4.2  省略了步驟3-去除基因組污染步驟。

建議：步驟3-去除基因組污染步驟必不可少，不能省略。DNA清除柱CS能極大限度的去除上清液中的基因組 DNA，使用裂解液RL plus洗脫下的RNA基本無基因組DNA的污染。

4.3  跳過了使用去蛋白液RD的漂洗步驟（見操作步驟第6步）。

建議：這一步驟對于除去殘留的 DNA 以及雜質(zhì)蛋白十分重要，一定不能省略，否則將會導(dǎo)致純化得到的 RNA 中含有DNA 污染和蛋白污染。

5. 純化獲得的RNA影響下游實(shí)驗(yàn)

經(jīng)吸附柱純化的 RNA，如果鹽離子、蛋白質(zhì)含量過多會影響下游實(shí)驗(yàn)，比如：逆轉(zhuǎn)錄、Northern Blot 等。

1.  洗脫后的 RNA 有鹽離子殘留。

建議：確認(rèn)漂洗液RW中添加了正確體積的乙醇，并按操作說明的離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行2次RW洗滌吸附柱 （見操作步驟第7，8步）。

2.  洗脫后的 RNA 有乙醇?xì)埩簟?

建議：確認(rèn) RW第二次洗滌后，按操作說明的對吸附柱進(jìn)行空管離心操作（見操作步驟第9 步），如果還有乙醇?xì)埩?，可以將空管離心后吸附柱開蓋常溫放置 5 min，以最大程度上去除乙醇?xì)埩簟?

RNA提取技術(shù)問題