RealPure Plant RNA Extraction Kit

（for containing high polysaccharide and polyphenol components）

RealPure多糖多酚植物RNA提取試劑盒

● 試劑盒內(nèi)容及保存：

● 儲(chǔ)存條件和效期：

RNase-free水4℃保存；其他試劑在常溫（25℃左右）干燥條件下，可保存1年。試劑盒常溫運(yùn)輸。

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

本試劑盒可從植物葉片、莖、幼苗、果肉中快速提取總RNA，可同時(shí)處理大量不同樣品。試劑盒配套緩沖液PRS（Phenolic Remove Solution）可以去除植物中的多糖多酚對(duì)RNA提取的影響。20-30分鐘內(nèi)即可完成反應(yīng)，提取的總RNA純度高，沒有DNA和蛋白的污染，可用于Northern blot、Dot blot、polyA 篩選、體外翻譯、RNase 保護(hù)分析和分子克隆等實(shí)驗(yàn)。

該試劑盒不能有效提取植物種子、塊莖、鱗莖的RNA，提取這些材料的RNA請(qǐng)選擇RealPure植物種子RNA提取試劑盒（Cat：RTR2308）。

● 準(zhǔn)備工作：

1操作前在裂解液RL中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如500 μl RL中加入5 μl β-巰基乙醇。此裂解液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的 RL4 ℃可放置3天。

2 按照標(biāo)簽所示在漂洗液RW中加入無水乙醇（自備），混勻后蓋緊瓶蓋后室溫貯存?zhèn)溆谩?

3 所有離心步驟均在常溫下進(jìn)行。

● 操作步驟：

1. 樣品處理:

1.1 1.5 ml離心管中加入500 μl裂解液RL（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入β-巰基乙醇），50 μl緩沖液PRS混勻備用。

注：多糖多酚植物（如銀杏，毛白楊等）加入RL后，要加入緩沖液PRS，普通植物（如擬南芥，小麥，水稻，煙草）可以不加緩沖液PRS。如果不能判斷植物是否為多糖多酚植物，請(qǐng)加入緩沖液PRS。

注：快速判斷是否為多糖多酚植物：

取20mg左右的植物材料，放入1.5 ml離心管中，加入0.5 ml 0.2 M NaOH溶液，95℃ 10分鐘，觀察裂解物顏色。顏色為綠色或淡黃色為普通植物；顏色為棕黃色或棕紅色為多糖多酚植物。

1.2將植物材料加入到液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀。取50 mg粉末迅速加入到離心管中，渦旋劇烈震蕩混勻，常溫放置5分鐘。

注：一定不要加入超過50 mg的粉末，否則樣品超過裂解液RL的裂解能力會(huì)導(dǎo)致RNA提取失敗。

背景知識(shí)：樣品處理量絕對(duì)不要超過RNA吸附柱處理能力，否則造成RNA殘留或者產(chǎn)量降低。不同植物組織RNA相差極大，例如某些植物種子如綠豆RNA含量豐富，超過50 mg就會(huì)超過柱子處理能力。所以開始摸索實(shí)驗(yàn)條件時(shí)，如果不清楚樣品RNA含量時(shí)寧可使用較少的樣品處理量，如植物葉片或植物種子裂解溶液中都不要超過50 mg，隨后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果增加或者減少處理量。

2. 離心取上清：

13,000 rpm離心5 min，小心吸取收集管中的上清至1.5 ml RNase-free的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細(xì)胞碎片沉淀。一般可獲得400 μl上清。

3. 去除基因組污染：

上清中加入0.5倍體積的無水乙醇（如400 μl上清中加入200 μl無水乙醇），混勻（此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀），得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入DNA清除柱CS（清除柱放入收集管中）中，13,000 rpm離心2分鐘，棄掉收集管中的廢液。

注：確保全部溶液都收集到收集管中，如果膜上有殘留液體，延長(zhǎng)離心時(shí)間至5分鐘，保證膜上無殘留液體。

4. 洗脫RNA：

  將DNA清除柱放入一干凈的2 ml離心管中，在清除柱中加入500 μl 裂解液RL plus，13,000 rpm離心1分鐘，收集濾液（注意：RNA在濾液中，不要丟棄），濾液中加入250 μl無水乙醇，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀，立即混勻，不要離心。

5. RNA掛柱：

  將全部溶液加入到RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中），13,000 rpm離心2分鐘。

注：確保溶液全部過濾到收集管中，膜上無殘留，如有必要，可以延長(zhǎng)離心時(shí)間至5分鐘。

6. 去除RNA中的蛋白污染：

向RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl 去蛋白液RD，13,000 rpm離心1分鐘，棄廢液。

7. 去除RNA中的其他雜質(zhì)：

向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入乙醇）， 13,000 rpm離心1分鐘，棄廢液。

8. 進(jìn)一步去除RNA中的其他雜質(zhì)：

向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW （使用前請(qǐng)先檢查是否已加入乙醇），13,000 rpm離心1

分鐘，棄廢液，將吸附柱CR放回收集管中，確保蓋好吸附柱管蓋。

9.  關(guān)鍵步驟：徹底去除吸附柱上的殘余乙醇：

13,000 rpm將吸附柱CR空甩離心2 分鐘，去除吸附柱上的殘余液體。

注：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，如果有漂洗液殘留，可能會(huì)影響后續(xù)的RT等實(shí)驗(yàn)操作。

10. 洗脫得到RNA：

將RNA吸附柱CR轉(zhuǎn)入一個(gè)新的1.5 ml RNase-free離心管中，向吸附柱O型墊圈中央懸空加入50-100 μl RNase-free水（事先65℃預(yù)熱可提高洗脫效率），蓋好吸附柱管蓋，常溫放置2分鐘，13,000 rpm離心2 分鐘。

注：確保水要加到膜的中央,不要貼壁加入;洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50 μl,體積過小影響回收效率。

11. RNA貯存：

RNA樣品-80℃中保存。

● RNA產(chǎn)量和質(zhì)量的評(píng)估：

1. RNA產(chǎn)量：

用分光光度計(jì)測(cè)定OD₂₆₀的吸光值來計(jì)算RNA產(chǎn)量。將RNA按照一定的比例稀釋于TE溶液（10mMTris pH8.0，1mMEDTA）中，根據(jù)以下公式計(jì)算：

A₂₆₀×稀釋倍數(shù)×40=μg RNA/ml

注：測(cè)定OD值時(shí)，盡量不要用RNase-free水稀釋RNA，因?yàn)镽Nase-free水pH較低，測(cè)定的OD值偏低。

2. RNA質(zhì)量：

凝膠電泳檢測(cè)：凝膠電泳中，完整的RNA應(yīng)該有兩條主帶：28S和18S，并且28S亮度應(yīng)該與18S相當(dāng)或是其亮度的2倍?？梢允褂闷胀ǖ?×TAE瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度1-1.5 %，可以使用高電壓，短時(shí)間電泳，如7V/cm電泳，20分鐘。建議使用D2000 DNA ladder（Cat：RTM415）作為Marker。植物28S rRNA遷移率與1500bp類似，18S rRNA遷移率與1000bp類似。

● 問題指南:

1. 離心柱發(fā)生堵塞       

離心柱發(fā)生堵塞之后會(huì)造成 RNA 得率降低甚至不能純化得到 RNA。

常見原因分析如下：

1.1：樣本破碎不徹底。

樣本破碎不徹底會(huì)使吸附柱發(fā)生堵塞，同時(shí)會(huì)影響 RNA 得率及質(zhì)量。我們建議在進(jìn)行樣本破碎的時(shí)候，在足量的液氮中快速研磨操作，盡量破碎樣本細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等組織。

1.2 樣本初始量過多。

樣本使用量過多會(huì)導(dǎo)致裂解液RL或裂解液RSL裂解細(xì)胞時(shí)不完全，導(dǎo)致離心柱堵塞。RealPure多糖多酚植物RNA提取試劑盒和RealPure植物種子RNA提取試劑盒處理樣本的初始最大量為50 mg。

1.3 離心機(jī)的溫度過低。

整個(gè) RNA 分離純化除了液氮破碎樣本組織外，所有的步驟均在常溫（20-25℃）進(jìn)行。有些低溫離心機(jī)的溫度低于 20℃，可能會(huì)造成離心柱的堵塞。如果發(fā)生這種現(xiàn)象，請(qǐng)將離心機(jī)溫度設(shè)置到 20-25℃。

2. 提取不到RNA或者RNA產(chǎn)量低

通常會(huì)有多種因素影響回收效率，比如：樣本 RNA 含量、操作方法、洗脫體積等。

常見原因分析：

2.1  樣本保存不當(dāng)或樣本保存時(shí)間過久導(dǎo)致RNA 已經(jīng)降解。

建議：新采集的樣本應(yīng)立即放入液氮中速凍，長(zhǎng)期保存于-70℃并避免樣本的反復(fù)凍融；或者將樣本立即浸泡在 RNA 穩(wěn)定劑RNAwait溶液中。

2.2  樣本破碎裂解不充分導(dǎo)致純化柱堵塞。

建議：在組織研磨時(shí)，請(qǐng)保證組織充分研磨，并在研磨完成后迅速轉(zhuǎn)移至預(yù)先準(zhǔn)備好的裂解液RL或裂解液RSL（確認(rèn)已添加正確比例的 β-ME）中。

2.3  洗脫液添加不正確。

建議：確認(rèn) RNase-Free 水滴加到了純化柱膜O型墊圈中央位置。

2.4  漂洗液RW中沒有添加正確體積的無水乙醇。

建議：請(qǐng)按照說明書，在試劑盒使用前，漂洗液RW中添加正確體積的無水乙醇并混勻。

2.5  組織樣本用量不合適。

建議：每 500 μl 裂解液RL或裂解液 RSL使用最大組織量50 mg，組織使用過多會(huì)導(dǎo)致 RNA 提取量降低并且得到的 RNA 純度也會(huì)降低。我們強(qiáng)烈建議每單次 RNA提取操作，樣本初始用量一定不要超過最大建議量。

2.6  洗脫體積不合適或洗脫不徹底。

建議：純化柱的洗脫液體積為 50-100 μl；若洗脫效果并不理想，建議在加入65℃預(yù)熱的RNase-Free 水后，延長(zhǎng)常溫放置的時(shí)間，例如放置 5-10 min。

2.7  純化柱在第二次RW洗滌之后有乙醇?xì)埩簟?

建議：漂洗液RW洗滌后，吸附柱空甩離心2 min是關(guān)鍵步驟，以充分除去吸附柱上殘留的乙醇。

2.8  試劑盒使用不正確。

建議：對(duì)于多酚多糖的植物樣本，務(wù)必使用緩沖液PRS，這是我們專門針對(duì)多酚多糖植物樣本而研制的多糖多酚去除劑，如不添加，將導(dǎo)致RNA不能掛柱或提取到純度不高的RNA。

3. 純化獲得的RNA有降解

純化得到的 RNA 的質(zhì)量和樣本的保存、RNase 污染、操作等因素有關(guān)。 常見原因分析：

3.1  組織樣本采集后沒有及時(shí)保存。

建議：組織樣本在收集后若不及時(shí)使用，請(qǐng)立即低溫保存于液氮中或經(jīng)液氮速凍后立即轉(zhuǎn)移至-70℃長(zhǎng)期保存，或者將樣本立即浸泡在 RNA 穩(wěn)定劑 RNAwait溶液中。提取 RNA 請(qǐng)盡量使用新近采取的組織樣本。

3.2  組織樣本反復(fù)凍融。

建議：組織樣本保存時(shí)，最好剪成小段保存，使用時(shí)取出其中一部分即可，避免樣本的反復(fù)凍融導(dǎo)致 RNA 的降解。

3.3  操作間有 RNase 引入或沒有佩戴一次性手套、口罩等。

建議：RNA 提取實(shí)驗(yàn)最好在單獨(dú)的 RNA 操作間進(jìn)行，并在實(shí)驗(yàn)前清理好實(shí)驗(yàn)桌，實(shí)驗(yàn)時(shí)佩戴一次性手套、口罩，最大程度上避免 RNase 引入導(dǎo)致的RNA 降解。

3.4  試劑在使用過程中被 RNase 污染。

建議：更換新的植物總RNA 提取系列試劑盒進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

3.5  RNA 操作時(shí)所用的離心管、槍頭等有 RNase 污染。

建議：確認(rèn) RNA 提取時(shí)所用到的離心管、槍頭、移液器等都是 RNase-Free。

4. RNA中含有DNA污染

4.1 提取的起始材料超過50 mg

建議：步驟1-樣品處理時(shí)用天平稱取粉末重量，不要超過50 mg，否則樣品的核酸量會(huì)超過DNA清除柱CS的處理極限，導(dǎo)致洗脫下的RNA有基因組DNA的污染。

4.2  省略了步驟3-去除基因組污染步驟。

建議：步驟3-去除基因組污染步驟必不可少，不能省略。DNA清除柱CS能極大限度的去除上清液中的基因組 DNA，使用裂解液RL plus洗脫下的RNA基本無基因組DNA的污染。

4.3  跳過了使用去蛋白液RD的漂洗步驟（見操作步驟第6步）。

建議：這一步驟對(duì)于除去殘留的 DNA 以及雜質(zhì)蛋白十分重要，一定不能省略，否則將會(huì)導(dǎo)致純化得到的 RNA 中含有DNA 污染和蛋白污染。

5. 純化獲得的RNA影響下游實(shí)驗(yàn)

經(jīng)吸附柱純化的 RNA，如果鹽離子、蛋白質(zhì)含量過多會(huì)影響下游實(shí)驗(yàn)，比如：逆轉(zhuǎn)錄、Northern Blot 等。

1.  洗脫后的 RNA 有鹽離子殘留。

建議：確認(rèn)漂洗液RW中添加了正確體積的乙醇，并按操作說明的離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行2次RW洗滌吸附柱 （見操作步驟第7，8步）。

2.  洗脫后的 RNA 有乙醇?xì)埩簟?

建議：確認(rèn) RW第二次洗滌后，按操作說明的對(duì)吸附柱進(jìn)行空管離心操作（見操作步驟第9 步），如果還有乙醇?xì)埩?，可以將空管離心后吸附柱開蓋常溫放置 5 min，以最大程度上去除乙醇?xì)埩簟?

實(shí)驗(yàn)示例：