RealPure Animal Tissues/Cell RNA Extraction Kit

RealPure動物組織/細胞RNA提取試劑盒

● 試劑盒內(nèi)容及保存：

● 儲存條件和效期：

RNase-free水4℃貯存；其他試劑在常溫（25℃左右）干燥條件下，可保存1年。試劑盒常溫運輸。

● 產(chǎn)品簡介：

本試劑盒可從動物組織中快速提取總RNA， 可同時處理大量不同樣品。提取的總RNA純度高，沒有蛋白和其它雜質(zhì)的污染，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、PolyA 篩選、體外翻譯、RNase 保護分析和分子克隆等多種下游實驗。

● 準備工作：

1操作前在裂解液RL中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如1 ml RL中加入10 μl β-巰基乙醇。此裂解液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的 RL4 ℃可放置3天。

2 按照標簽所示在漂洗液RW中加入無水乙醇（自備），混勻后蓋緊瓶蓋后常溫貯存?zhèn)溆谩?/span>

3 所有離心步驟均在常溫下進行。

● 操作步驟：

1. 樣品處理和裂解:

1.1 貼壁細胞：

1.1.1直接裂解法：

不需胰酶消化，徹底吸干凈培養(yǎng)液體后直接加推薦量裂解液 RL（使用前請先檢查是否已加入β-巰基乙醇）（下表）反復吹打細胞裂解，可以漩渦震蕩，直到看不到細胞團為止，進行步驟2。

1.1. 2 胰蛋白酶消化法：

確定細胞數(shù)量（收集細胞數(shù)量請不要超過1×10⁷），吸除培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞，吸除PBS，向細胞中加入胰酶消化液處理細胞，當細胞脫離容器壁時，加入含有血清的培養(yǎng)基失活胰蛋白酶，將細胞溶液轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，300×g離心5 min，收集細胞沉淀，仔細吸除所有上清，加 350 μl（<5x10⁶細胞）或 600 μl（5x10⁶-1x10⁷細胞）裂解液 RL（使用前請先檢查是否已加入β-巰基乙醇），反復吹打細胞裂解，可以漩渦震蕩，直到看不到細胞團為止，進行步驟2。

1.2 懸浮細胞：

300×g離心 5 min收集懸浮細胞（收集細胞數(shù)量請不要超過1×10⁷）到一個1.5ml 離心管中，完全吸棄上清，加 350 μl（<5x10⁶細胞）或 600 μl（5x10⁶-1x10⁷細胞）裂解液 RL（使用前請先檢查是否已加入β-巰基乙醇），反復吹打細胞裂解，可以漩渦震蕩，直到看不到細胞團為止，進行步驟2。

   1.3 動物組織：

       新鮮組織加入350 μl(<20mg 組織)或者 600 μl(20-30mg 組織)的裂解液RL（使用前請先檢查是否已加入β-巰基乙醇）后玻璃勻漿器或電動勻漿器將組織徹底研磨勻漿，進行步驟2。

注意：組織量一定不要超過30 mg，否則將導致RNA得率和質(zhì)量下降。

背景知識：樣品處理量絕對不要超過DNA/RNA吸附柱處理能力，否則造成DNA/RNA殘留或者產(chǎn)量降低。不同組織細胞種類DNA/RNA相差極大，例如胸腺脾臟DNA含量豐富，超過5 mg就會超過柱子處理能力。COS細胞RNA含量豐富，超過3x10⁶細胞就會超過柱子吸附能力。所以開始摸索實驗條件時，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時寧可使用較少的樣品處理量，如細胞不超過3-4x10⁶，組織不超過10mg，隨后根據(jù)實驗結(jié)果增加或者減少處理量。

2. 離心得到上清：

若沒有不溶性沉淀，直接進行步驟3。如有不能裂解的碎片或者不溶物，13,000 rpm離心5 min, 取裂解物上清進行下一步。

3. 去除基因組污染和洗脫RNA：

將DNA清除柱CS放入一干凈的2 ml離心管內(nèi)，用移液器小心將步驟1離心管內(nèi)的溶液或步驟2離心后的上清全部轉(zhuǎn)移到DNA清除柱CS中，13,000 rpm離心2分鐘（RNA在離心管濾液中,不要丟棄）。

注：確保全部溶液都收集到2 ml離心管中，如果膜上有殘留液體，延長離心時間至5分鐘，保證膜上無殘留液體。

4. RNA掛柱：

  向2 ml離心管濾液中加入0.5倍體積的無水乙醇（如濾液體積為300 μl/600 μl，加入150 μl/300 μl無水乙醇），此時可能會出現(xiàn)沉淀，立即混勻，不要離心。將全部溶液加入到RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中），13,000 rpm離心1分鐘。

注：確保溶液全部過濾到收集管中，膜上無殘留，如有必要，可以延長離心時間至5分鐘。

5. 去除RNA中的蛋白污染：

向RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl 去蛋白液RD，13,000 rpm離心1分鐘，棄廢液。

6. 去除RNA中的其他雜質(zhì)：

向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW（使用前請先檢查是否已加入乙醇）， 13,000 rpm離心1分鐘，棄廢液。

7. 進一步去除RNA中的其他雜質(zhì)：

向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW （使用前請先檢查是否已加入乙醇），13,000 rpm離心1

分鐘，棄廢液。

8.  關鍵步驟：徹底去除吸附柱上的殘余乙醇：

將吸附柱CR放回收集管中，確保蓋好吸附柱管蓋，13,000 rpm將吸附柱CR空甩離心2 分鐘，去除吸附柱上的殘余液體。

注：此步驟目的是將吸附柱中殘余漂洗液去除，如果有漂洗液殘留，可能會影響后續(xù)的RT等實驗操作。

9. 洗脫得到RNA：

將RNA吸附柱CR轉(zhuǎn)入一個新的1.5 ml RNase-free離心管中，向吸附柱O型墊圈中央懸空加入50-100 μl RNase-free水（事先65℃預熱可提高洗脫效率），蓋好吸附柱管蓋，常溫放置2分鐘，13,000 rpm離心2 分鐘。

注：確保水要加到膜的中央，不要貼壁加入；洗脫緩沖液體積不應少于50 μl，體積過小影響回收效率。

10.  RNA貯存：

RNA樣品-80℃中保存。

● RNA產(chǎn)量和質(zhì)量的評估：

1. RNA產(chǎn)量：

用分光光度計測定OD₂₆₀的吸光值來計算RNA產(chǎn)量。將RNA按照一定的比例稀釋于TE溶液（10mMTris pH8.0，1mMEDTA）中，根據(jù)以下公式計算：

A₂₆₀×稀釋倍數(shù)×40=μg RNA/ml

注：測定OD值時，盡量不要用RNase-free水稀釋RNA，因為RNase-free水pH較低，測定的OD值偏低。

2. RNA質(zhì)量：

凝膠電泳檢測：凝膠電泳中，動物的完整RNA應該有兩條主帶：28S和18S，并且28S亮度應該與18S相當或是其亮度的2倍?？梢允褂闷胀ǖ?×TAE瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度1-1.5 %，可以使用高電壓，短時間電泳，如7V/cm電泳，20分鐘。建

議使用D2000 DNA ladder（Cat：RTM415）作為Marker。28S rRNA遷移率與1800bp類似，18S rRNA遷移率與700bp類似。

吸光值檢測：可以用A₂₃₀，A₂₆₀和A₂₈₀的數(shù)值表示RNA的純度。純凈的RNA的 A₂₆₀/A₂₈₀比值應該為2，我們得到的RNA樣品比值應在1.8-2.2之間，如果比值低于1.8，表明RNA樣品中蛋白污染比較嚴重。A₂₆₀/A₂₃₀比值應該在2-2.2之間。如果此比值低于2，表明RNA樣品中有胍鹽的污染。

 ● 實驗示例:

                          1.2%瓊脂糖膠   1×TAE 150V 25min RealSafe Red預染

RNA提取試劑提取步驟：K562懸浮細胞，1 ml收集（6×10⁶/ml），PBS漂洗兩遍，加入1 ml RNA提取試劑，懸浮后常溫靜置10分鐘，加入氯仿或氯仿替代物200 μl，徹底混勻后靜置10分鐘，自然分相，4度 13000 rpm 離心15分鐘，上清中加入等體積異丙醇，常溫靜置20分鐘，4度 13000 rpm離心15分鐘，沉淀用1 ml 75%乙醇漂洗，4度 8000rpm 離心2分鐘，沉淀溶于50μl RNase-free水中。

RTR2306操作簡述如下：K562懸浮細胞，1ml收集（6×10⁶/ml），PBS漂洗兩遍（平行做2管）。沉淀中加入350 μl 裂解液RL（已加β-ME），常溫裂解5分鐘，裂解物加到DNA清除柱CS中，離心收集到2 ml離心管中，離心管中加入0.5倍體積無水乙醇，全部溶液加到RNA吸附柱CR中，離心，隨后清除柱CS和RNA吸附柱CR一次RD漂洗，2次RW漂洗，最后每個吸附柱用50 μl RNase-free水洗脫，合并兩管得到100 μl RNA和100 μl去除的基因組DNA。

● 問題指南:

1. 離心柱發(fā)生堵塞

離心柱發(fā)生堵塞之后會造成 RNA 得率降低甚至不能純化得到 RNA。

常見原因分析如下：

1.1組織或細胞破碎不徹底。

破碎不徹底會使吸附柱發(fā)生堵塞，同時會影響 RNA 得率及質(zhì)量。我們建議在進行裂解時，盡量借助輔助手段如機械勻漿徹底破碎組織。

1.2 樣本初始量過多。

樣本使用量過多會導致裂解液RL裂解細胞時不完全，導致離心柱堵塞。該試劑盒處理樣本的初

始最大量10⁷細胞或30 mg組織。

1.3 離心機的溫度過低。

整個 RNA 分離純化所有的步驟均在常溫（20-25℃）進行。有些低溫離心機的溫度低于 20℃，可能會造成離心柱的堵塞。如果發(fā)生這種現(xiàn)象，請將離心機溫度設置到 20-25℃。

2. 提取不到RNA或者RNA產(chǎn)量低

通常會有多種因素影響回收效率，比如：樣本 RNA 含量、操作方法、洗脫體積等。

常見原因分析：

2.1  樣本保存不當或樣本保存時間過久導致RNA 已經(jīng)降解。

建議：新采集的樣本應立即放入液氮中速凍，長期保存于-70℃并避免樣本的反復凍融；或者將樣本立即浸泡在 RNA 穩(wěn)定劑RNAwait溶液中。

2.2  樣本破碎裂解不充分導致純化柱堵塞。

建議：參見1。

2.3  洗脫液添加不正確。

建議：確認 RNase-Free 水滴加到了純化柱膜O型墊圈中央位置。

2.4  漂洗液RW中沒有添加正確體積的無水乙醇。

建議：請按照說明書，在試劑盒使用前，漂洗液RW中添加正確體積的無水乙醇并混勻。

2.5  組織樣本用量不合適。

建議：每 600 μl 裂解液RL使用最大細胞量為1×10⁷，使用最大組織量為30 mg，過多會導致 RNA 提取量降低并且得到的 RNA 純度也會降低。我們強烈建議每單次 RNA提取操作，樣本初始用量一定不要超過最大建議量。

2.6  洗脫體積不合適或洗脫不徹底。

建議：純化柱的洗脫液體積為 50-100 μl；若洗脫效果并不理想，建議在加入65℃預熱的RNase-Free 水后，延長常溫放置的時間，例如放置 5-10 min。

2.7  純化柱在第二次RW洗滌之后有乙醇殘留。

建議：漂洗液RW洗滌后，吸附柱空甩離心2 min是關鍵步驟，以充分除去吸附柱上殘留的乙醇。

3. 純化獲得的RNA有降解

純化得到的 RNA 的質(zhì)量和樣本的保存、RNase 污染、操作等因素有關。

常見原因分析：

3.1  組織樣本采集后沒有及時保存。

建議：組織樣本在收集后若不及時使用，請立即低溫保存于液氮中或經(jīng)液氮速凍后立即轉(zhuǎn)移至-70℃

長期保存，或者將樣本立即浸泡在 RNA 穩(wěn)定劑 RNAwait溶液中。提取 RNA 請盡量使用新近采取的組織樣本。

3.2  組織樣本反復凍融。

建議：組織樣本保存時，最好分裝成小份，使用時取出其中一份即可，避免樣本的反復凍融導致 RNA 的降解。

3.3  操作間有 RNase 引入或沒有佩戴一次性手套、口罩等。

建議：RNA 提取實驗最好在單獨的 RNA 操作間進行，并在實驗前清理好實驗桌，實驗時佩戴一次性手套、口罩，最大程度上避免 RNase 引入導致的RNA 降解。

3.4  試劑在使用過程中被 RNase 污染。

建議：更換新的提取試劑盒進行相關實驗。

3.5  RNA 操作時所用的離心管、槍頭等有 RNase 污染。

建議：確認 RNA 提取時所用到的離心管、槍頭、移液器等都是 RNase-Free。

4. RNA中含有DNA污染

4.1 提取的起始材料量超過最大建議量

建議：步驟1-樣品處理時使用10⁷細胞或30 mg組織，不要超過最大處理量，否則樣品的核酸量會超過DNA清除柱CS的處理極限，導致洗脫下的RNA有基因組DNA的污染。

4.2  省略了步驟3-去除基因組污染步驟。

建議：步驟3-去除基因組污染步驟必不可少，不能省略。DNA清除柱CS能極大限度的去除上清液中的基因組 DNA，使用裂解液RL洗脫下的RNA基本無基因組DNA的污染。

4.3  跳過了使用去蛋白液RD的漂洗步驟（見操作步驟第5步）。

建議：這一步驟對于除去殘留的 DNA 以及雜質(zhì)蛋白十分重要，一定不能省略，否則將會導致純化得到的 RNA 中含有DNA 污染和蛋白污染。

5. 純化獲得的RNA影響下游實驗

經(jīng)吸附柱純化的 RNA，如果鹽離子、蛋白質(zhì)含量過多會影響下游實驗，比如：逆轉(zhuǎn)錄、Northern Blot 等。

1.  洗脫后的 RNA 有鹽離子殘留。

建議：確認漂洗液RW中添加了正確體積的乙醇，并按操作說明的離心轉(zhuǎn)速進行2次RW洗滌吸附柱 （見操作步驟第6，7步）。

2.  洗脫后的 RNA 有乙醇殘留。

RNA提取技術問題