RealPure Bacterial RNA Extraction Kit

RealPure細(xì)菌RNA提取試劑盒

● 試劑盒內(nèi)容及保存：

● 儲(chǔ)存條件和效期：

RNase-free水和溶菌酶4℃保存；其他試劑在常溫（25℃左右）干燥條件下，可保存1年。試劑盒常溫運(yùn)輸。

● 產(chǎn)品簡介：

本試劑盒適用于快速提取細(xì)菌總RNA，使用DNA清除柱CS確保有效濾除gDNA殘留，不需要使用DNase消化，得到的RNA可直接用于反轉(zhuǎn)錄PCR，熒光定量PCR.。

● 準(zhǔn)備工作：

1操作前在裂解液RL中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如500 μl RSL中加入5 μl β-巰基乙醇。此裂解液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的 RSL4 ℃可放置3天。

2 按照標(biāo)簽所示在漂洗液RW中加入無水乙醇（自備），混勻后蓋緊瓶蓋后常溫貯存?zhèn)溆谩?

3 按照標(biāo)簽所示在溶菌酶中加入TE溶液，混勻溶解后-20℃貯存。

4 所有離心步驟均在常溫下進(jìn)行。

● 操作步驟：

1. 樣品處理和裂解:

1.1 1-2 ml菌液(約10⁸-10⁹細(xì)胞)加入到1.5 ml離心管中，13000 rpm 離心2 分鐘，棄上清，離心快甩，用移液器吸頭盡可能吸盡上清（如果培養(yǎng)基上清去除不完全，將對(duì)細(xì)胞壁的酶解消化過程產(chǎn)生抑制）。

注：E.coli菌株OD₆₀₀ =0.5 相當(dāng)于1×10⁹個(gè)細(xì)菌。

1.2 菌體中加入100 μl酶溶液，渦旋震蕩20秒， 按照下表處理。

注：不同細(xì)菌破壁難易程度不同，客戶根據(jù)細(xì)菌種類選擇合適的酶種類和破壁程序。

1.3 酶解后的菌體中加入500 μl裂解液RL（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入β-巰基乙醇），混勻。

2. 離心得到上清（可選步驟）：

若沒有不溶性沉淀，直接進(jìn)行步驟3。如有不能裂解的碎片或者不溶物，13,000 rpm離心5 min, 取裂解物上清進(jìn)行下一步。

3. 去除基因組污染和洗脫RNA：

將DNA清除柱CS放入一干凈的2 ml離心管內(nèi)，用移液器小心將步驟2離心管內(nèi)的溶液或離心后的上清全部轉(zhuǎn)移到DNA清除柱CS中，13,000 rpm離心2分鐘（RNA在離心管濾液中，不要丟棄）。

注：確保全部溶液都收集到2 ml離心管中，如果膜上有殘留液體，延長離心時(shí)間至5分鐘，保證膜上無殘留液體。

4. RNA掛柱：

  向2 ml離心管濾液中加入0.5倍體積的無水乙醇（如濾液體積為500 μl，加入250 μl無水乙醇），此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀，立即混勻，不要離心。將全部溶液加入到RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中），13,000 rpm離心1分鐘。

注：確保溶液全部過濾到收集管中，膜上無殘留，如有必要，可以延長離心時(shí)間至5分鐘。

5. 去除RNA中的蛋白污染：

向RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl 去蛋白液RD，13,000 rpm離心1分鐘，棄廢液。

6. 去除RNA中的其他雜質(zhì)：

向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入乙醇）， 13,000 rpm離心1分鐘，棄廢液。

7. 進(jìn)一步去除RNA中的其他雜質(zhì)：

向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW （使用前請(qǐng)先檢查是否已加入乙醇），13,000 rpm離心1

分鐘，棄廢液。

8.  關(guān)鍵步驟：徹底去除吸附柱上的殘余乙醇：

將吸附柱CR放回收集管中，確保蓋好吸附柱管蓋，13,000 rpm將吸附柱CR空甩離心2 分鐘，去除吸附柱上的殘余液體。

注：此步驟目的是將吸附柱中殘余漂洗液去除，如果有漂洗液殘留，可能會(huì)影響后續(xù)的RT等實(shí)驗(yàn)操作。

9. 洗脫得到RNA：

將RNA吸附柱CR轉(zhuǎn)入一個(gè)新的1.5 ml RNase-free離心管中，向吸附柱O型墊圈中央懸空加入50-100 μl RNase-free水（事先65℃預(yù)熱可提高洗脫效率），蓋好吸附柱管蓋，常溫放置2分鐘，13,000 rpm離心2 分鐘。

注：確保水要加到膜的中央，不要貼壁加入；洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50 μl，體積過小影響回收效率。

10.  RNA貯存：

RNA樣品-80℃中保存。

● RNA產(chǎn)量和質(zhì)量的評(píng)估：

1. RNA產(chǎn)量：

用分光光度計(jì)測(cè)定OD₂₆₀的吸光值來計(jì)算RNA產(chǎn)量。將RNA按照一定的比例稀釋于TE溶液（10mMTris pH8.0，1mMEDTA）中，根據(jù)以下公式計(jì)算：

A₂₆₀×稀釋倍數(shù)×40=μg RNA/ml

注：測(cè)定OD值時(shí)，盡量不要用RNase-free水稀釋RNA，因?yàn)镽Nase-free水pH較低，測(cè)定的OD值偏低。

大腸桿菌DH5α RNA得率為20-30μg/ml 菌液OD₆₀₀=0.5

2. RNA質(zhì)量：

凝膠電泳檢測(cè)：凝膠電泳中，細(xì)菌的完整RNA應(yīng)該有兩條主帶：26S和13S，并且26S亮度應(yīng)該與13S相當(dāng)或是其亮度的2倍?？梢允褂闷胀ǖ?×TAE瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度1-1.5 %，可以使用高電壓，短時(shí)間電泳，如7V/cm電泳，20分鐘。建議使用D2000 DNA ladder（Cat：RTM415）作為Marker。細(xì)菌26S rRNA遷移率與800bp類似，13S rRNA遷移率與700bp類似。

吸光值檢測(cè)：可以用A₂₃₀，A₂₆₀和A₂₈₀的數(shù)值表示RNA的純度。純凈的RNA的 A₂₆₀/A₂₈₀比值應(yīng)該為2，我們得到的RNA樣品比值應(yīng)在1.8-2.2之間，如果比值低于1.8，表明RNA樣品中蛋白污染比較嚴(yán)重。A₂₆₀/A₂₃₀比值應(yīng)該在2-2.2之間。如果此比值低于2，表明RNA樣品中有胍鹽的污染。

●  實(shí)驗(yàn)示例:

● 問題指南:

1. 離心柱發(fā)生堵塞

離心柱發(fā)生堵塞之后會(huì)造成 RNA 得率降低甚至不能純化得到 RNA。

常見原因分析如下：

1.1細(xì)菌破碎不徹底。

細(xì)菌破碎不徹底會(huì)使吸附柱發(fā)生堵塞，同時(shí)會(huì)影響 RNA 得率及質(zhì)量。我們建議在進(jìn)行細(xì)菌破壁時(shí)，盡量破碎細(xì)菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等組織。

1.2 樣本初始量過多。

樣本使用量過多會(huì)導(dǎo)致裂解液RL plus裂解細(xì)胞時(shí)不完全，導(dǎo)致離心柱堵塞。該試劑盒處理樣本的初始最大量10⁸-10⁹細(xì)菌細(xì)胞。

1.3 離心機(jī)的溫度過低。

整個(gè) RNA 分離純化所有的步驟均在常溫（20-25℃）進(jìn)行。有些低溫離心機(jī)的溫度低于 20℃，可能會(huì)造成離心柱的堵塞。如果發(fā)生這種現(xiàn)象，請(qǐng)將離心機(jī)溫度設(shè)置到 20-25℃。

2. 提取不到RNA或者RNA產(chǎn)量低

通常會(huì)有多種因素影響回收效率，比如：樣本 RNA 含量、操作方法、洗脫體積等。

常見原因分析：

2.1  樣本保存不當(dāng)或樣本保存時(shí)間過久導(dǎo)致RNA 已經(jīng)降解。

建議：新采集的樣本應(yīng)立即放入液氮中速凍，長期保存于-70℃并避免樣本的反復(fù)凍融；或者將樣本立即浸泡在 RNA 穩(wěn)定劑RNAwait溶液中。

2.2  樣本破碎裂解不充分導(dǎo)致純化柱堵塞。

建議：溶菌酶破壁時(shí)，確保破壁完全。革蘭氏陽性菌注意破壁溫度和時(shí)間。

2.3  洗脫液添加不正確。

建議：確認(rèn) RNase-Free 水滴加到了純化柱膜O型墊圈中央位置。

2.4  漂洗液RW中沒有添加正確體積的無水乙醇。

建議：請(qǐng)按照說明書，在試劑盒使用前，漂洗液RW中添加正確體積的無水乙醇并混勻。

2.5  組織樣本用量不合適。

建議：每 500 μl 裂解液RL使用最大細(xì)菌量10⁹，使用過多會(huì)導(dǎo)致 RNA 提取量降低并且得到的 RNA 純度也會(huì)降低。我們強(qiáng)烈建議每單次 RNA提取操作，樣本初始用量一定不要超過最大建議量。

2.6  洗脫體積不合適或洗脫不徹底。

建議：純化柱的洗脫液體積為 50-100 μl；若洗脫效果并不理想，建議在加入65℃預(yù)熱的RNase-Free 水后，延長常溫放置的時(shí)間，例如放置 5-10 min。

2.7  純化柱在第二次RW洗滌之后有乙醇?xì)埩簟?

建議：漂洗液RW洗滌后，吸附柱空甩離心2 min是關(guān)鍵步驟，以充分除去吸附柱上殘留的乙醇。

3. 純化獲得的RNA有降解

純化得到的 RNA 的質(zhì)量和樣本的保存、RNase 污染、操作等因素有關(guān)。

常見原因分析：

3.1  組織樣本采集后沒有及時(shí)保存。

建議：組織樣本在收集后若不及時(shí)使用，請(qǐng)立即低溫保存于液氮中或經(jīng)液氮速凍后立即轉(zhuǎn)移至-70℃

長期保存，或者將樣本立即浸泡在 RNA 穩(wěn)定劑 RNAwait溶液中。提取 RNA 請(qǐng)盡量使用新近采取的組織樣本。

3.2  組織樣本反復(fù)凍融。

建議：組織樣本保存時(shí)，最好分裝成小份，使用時(shí)取出其中一份即可，避免樣本的反復(fù)凍融導(dǎo)致 RNA 的降解。

3.3  操作間有 RNase 引入或沒有佩戴一次性手套、口罩等。

建議：RNA 提取實(shí)驗(yàn)最好在單獨(dú)的 RNA 操作間進(jìn)行，并在實(shí)驗(yàn)前清理好實(shí)驗(yàn)桌，實(shí)驗(yàn)時(shí)佩戴一次性手套、口罩，最大程度上避免 RNase 引入導(dǎo)致的RNA 降解。

3.4  試劑在使用過程中被 RNase 污染。

建議：更換新的植物總RNA 提取系列試劑盒進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

3.5  RNA 操作時(shí)所用的離心管、槍頭等有 RNase 污染。

建議：確認(rèn) RNA 提取時(shí)所用到的離心管、槍頭、移液器等都是 RNase-Free。

4. RNA中含有DNA污染

4.1 提取的起始菌體量超過最大建議量

建議：步驟1-樣品處理時(shí)使用10⁸-10⁹細(xì)菌，不要超過最大處理量，否則樣品的核酸量會(huì)超過DNA清除柱CS的處理極限，導(dǎo)致洗脫下的RNA有基因組DNA的污染。

4.2  省略了步驟3-去除基因組污染步驟。

建議：步驟3-去除基因組污染步驟必不可少，不能省略。DNA清除柱CS能極大限度的去除上清液中的基因組 DNA，使用裂解液RL plus洗脫下的RNA基本無基因組DNA的污染。

4.3  跳過了使用去蛋白液RD的漂洗步驟（見操作步驟第5步）。

建議：這一步驟對(duì)于除去殘留的 DNA 以及雜質(zhì)蛋白十分重要，一定不能省略，否則將會(huì)導(dǎo)致純化得到的 RNA 中含有DNA 污染和蛋白污染。

5. 純化獲得的RNA影響下游實(shí)驗(yàn)

經(jīng)吸附柱純化的 RNA，如果鹽離子、蛋白質(zhì)含量過多會(huì)影響下游實(shí)驗(yàn)，比如：逆轉(zhuǎn)錄、Northern Blot 等。

1.  洗脫后的 RNA 有鹽離子殘留。

建議：確認(rèn)漂洗液RW中添加了正確體積的乙醇，并按操作說明的離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行2次RW洗滌吸附柱 （見操作步驟第6，7步）。

2.  洗脫后的 RNA 有乙醇?xì)埩簟?

建議：確認(rèn) RW第二次洗滌后，按操作說明的對(duì)吸附柱進(jìn)行空管離心操作（見操作步驟第8 步），如果還有乙醇?xì)埩簦梢詫⒖展茈x心后吸附柱開蓋常溫放置 5 min，以最大程度上去除乙醇?xì)埩簟?

RNA提取技術(shù)問題