RealPure^®Plant Seed RNA Extraction Kit

RealPure^®植物種子RNA提取試劑盒

● 試劑盒內(nèi)容及保存：

● 儲存條件和效期：

RNase-free水4℃保存；其他試劑在常溫（25℃左右）干燥條件下，可保存1年。試劑盒常溫運輸。

● 產(chǎn)品簡介：

本試劑盒可從植物種子中快速提取總RNA，通過獨特的裂解系統(tǒng)，快速去除植物組織中的淀粉、多糖等成分，釋放 RNA。試劑盒配套緩沖液PRS（Phenolic Remove Solution）可以去除種子中的多糖多酚對RNA提取的影響。另外，試劑盒配套DNA清除柱，可以消除基因組DNA的污染。整個提取過程僅需20-30分鐘內(nèi)即可完成，可以從50 mg植物種子中提取數(shù)十微克高純度RNA，基本沒有DNA和蛋白的污染，可用于Northern blot、Dot blot、polyA 篩選、體外翻譯、RNase 保護分析和分子克隆等實驗。

已經(jīng)測試的植物種子有：擬南芥干種子、小麥干種子、水稻干種子、芝麻種子、玉米干種子、豌豆種子、紅豆干種子、綠豆干種子、向日葵種子、西瓜種子、油莎豆、花生、大豆等。另外，該試劑盒也適合于提取塊莖、鱗莖的RNA。

植物RNA提取介紹：

由于植物種類繁多，不同的植物種類和部位的樣品使用本試劑盒效果不同。我們已經(jīng)測試成功的植物列表如下：

注：+ 表示添加，-表示不添加， +/- 表示添加不添加均可， NA表示無數(shù)據(jù)

● 準備工作：

1操作前在裂解液RSL中加入β-巰基乙醇至終濃度5%，如500 μl RSL中加入25 μl β-巰基乙醇。此裂解液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的 RSL4 ℃可放置3天。

2 按照標簽所示在漂洗液RW中加入無水乙醇（自備），混勻后蓋緊瓶蓋后常溫貯存?zhèn)溆谩?

3 準備65℃水浴

4 所有離心步驟均在常溫下進行。

● 操作步驟：

1. 樣品處理:

1.1 1.5 ml RNase-free離心管中加入500 μl裂解液RSL（使用前請先檢查是否已加入β-巰基乙醇），50 μl緩沖液PRS混勻備用。

   注：緩沖液PRS有助于去除樣品中的多糖和多酚，禾本科植物如水稻，小麥和玉米的種子RNA提取中可以不用添加；如不能判斷材料是否含多糖和多酚，請加入緩沖液PRS。

1.2將種子加入到液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀。取20-50 mg粉末迅速加入到離心管中，渦旋劇烈震蕩混勻，65℃水浴放置5分鐘，間歇混勻。

注：一定不要加入超過50 mg的粉末，否則樣品超過裂解液RSL的裂解能力導致RNA提取失敗。

2. 離心取上清：

13,000 rpm離心5 min，小心吸取收集管中的上清至1.5 ml RNase-free的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細胞碎片沉淀。一般可獲得400 μl上清。

注：一些種子富含油脂如花生種子，離心后脂肪位于最上層，用吸頭穿越脂肪層吸取上清；禾本科植物如水稻，小麥，玉米，高粱種子會有大量沉淀生產(chǎn)。

3. 去除基因組污染：

上清中加0.5倍體積的無水乙醇（如400 μl上清中加入200 μl無水乙醇），混勻（此時可能會出現(xiàn)沉淀），得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入DNA清除柱CS（清除柱放入收集管中）中，13,000 rpm離心2分鐘，棄掉收集管中的廢液。

注：吸附柱的最大容積是850 μl，超過此體積分步上柱，確保全部溶液都通過過濾柱，如果膜上有殘留液體，延長離心時間至5分鐘，保證膜上無殘留液體。

4. 洗脫RNA：

  將DNA清除柱放入2 m l RNase-free離心管中，在清除柱中加入500 μl 裂解液RL plus，13,000 rpm離心1分鐘，收集濾液（注意：RNA在濾液中，不要丟棄），濾液中加入250 μl無水乙醇，此時可能會出現(xiàn)沉淀，立即混勻，不要離心。

5. RNA掛柱：

  將全部溶液加入到RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中），13,000 rpm離心2分鐘，棄廢液。

注：確保溶液全部過濾到收集管中，膜上無殘留，如有必要，可以延長離心時間至5分鐘。

6. 去除RNA中的蛋白污染：

向RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl 去蛋白液RD，13,000 rpm離心1分鐘，棄廢液。

7. 去除RNA中的其他雜質(zhì)：

向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW（使用前請先檢查是否已加入乙醇）， 13,000 rpm離心1分鐘，棄廢液。

8. 進一步去除RNA中的其他雜質(zhì)：

向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW （使用前請先檢查是否已加入乙醇），13,000 rpm離心1

分鐘，棄廢液。

9.  關(guān)鍵步驟：徹底去除吸附柱上的殘余乙醇：

將吸附柱CR放回收集管中，確保蓋好吸附柱管蓋，13,000 rpm將吸附柱CR空甩離心2 分鐘，去除吸附柱上的殘余液體。

注：此步驟目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，如果有漂洗液殘留，可能會影響后續(xù)的RT等實驗操作。

10. 洗脫得到RNA：

將RNA吸附柱CR轉(zhuǎn)入一個新的1.5 ml RNase-free離心管中，向吸附柱O型墊圈中央懸空加入50-100 μl RNase-free水（事先65℃預(yù)熱可提高洗脫效率），蓋好吸附柱管蓋，常溫放置2分鐘，13,000 rpm離心2 分鐘。

注：確保水要加到膜的中央，不要貼壁加入；洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50 μl，體積過小影響回收效率。

11. RNA貯存：

RNA樣品-80℃中保存。

● RNA產(chǎn)量和質(zhì)量的評估：

1. RNA產(chǎn)量：

用分光光度計測定OD₂₆₀的吸光值來計算RNA產(chǎn)量。將RNA按照一定的比例稀釋于TE溶液（10mMTris pH8.0，1mMEDTA）中，根據(jù)以下公式計算：

A₂₆₀×稀釋倍數(shù)×40=μg RNA/ml

注：測定OD值時，盡量不要用RNase-free水稀釋RNA，因為RNase-free水pH較低，測定的OD值偏低。

2. RNA質(zhì)量：

凝膠電泳檢測：凝膠電泳中，完整的RNA應(yīng)該有兩條主帶：28S和18S，并且28S亮度應(yīng)該與18S相當或是其亮度的2倍?？梢允褂闷胀ǖ?×TAE瓊脂糖凝膠電泳，凝膠濃度1.5 %，可以使用高電壓，短時間電泳，如7V/cm電泳，20分鐘。建議使用D2000 DNA ladder（Cat：RTM415）作為Marker。植物28S rRNA遷移率與1500 bp類似，18S rRNA遷移率與1000bp類似。

吸光值檢測：可以用A₂₃₀，A₂₆₀和A₂₈₀的數(shù)值表示RNA的純度。純凈的RNA的 A₂₆₀/A₂₈₀比值應(yīng)該為2，我們得到的RNA樣品比值應(yīng)在1.8-2.2之間，如果比值低于1.8，表明RNA樣品中蛋白污染比較嚴重。

A₂₆₀/A₂₃₀比值應(yīng)該在2-2.2之間。如果此比值低于2，表明RNA樣品中有胍鹽，多糖的污染。

實驗示例：

RNA提取技術(shù)問題

RTR2308 RealPure植物種子RNA提取試劑盒發(fā)表文章列表：

1. [2022 IF=6.5] Metabolic pathways modulated by coumarin to inhibit seed germination and early seedling growth in Eleusine indica.

植物：牛筋草

Author: Tai-Jie Zhang, Zhao Ma, Hong-Ju Ma, Xing-Shan Tian, Wen-Lei Guo, Chun Zhang.

Journal: Plant Physiology and Biochemistry 203 (2023) 108035

Institution: Institute of Plant Protection, Guangdong Academy of Agricultural Sciences

Paper link：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0981942823005466