植物原生質體制備及轉化試劑盒                               

●  產品組成：

● 產品簡介：

植物原生質體是指脫去全部細胞壁由質膜包被的具有生命活力的裸露細胞。它具有細胞生命特征和全能型，是細胞無性系變異和突變體篩選的重要來源，同時也是植物遺傳工程的理想受體和遺傳改良的理想材料。酶解法分離原生質體是一個常用的技術，其原理是植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶、離析酶和果膠酶能降解細胞壁成分，去除細胞壁，即可得到原生質體。許多方法可誘導原生質體融合，現(xiàn)在被廣泛采用的融合方法是聚乙二醇（PEG）法。聚乙二醇（PEG）作為一種高分子化合物，合適的濃度能對原生質體產生瞬間沖擊效應，原生質體很快發(fā)生收縮與粘連，隨后用高鈣高pH法進行清洗，使原生質體融合得以完成。

按照每次使用5 ml酶消化體系計算，本試劑盒可用于40次酶消化反應。本試劑盒每個5 ml反應體系可處理0.1 g左右的擬南芥葉片(約10~15葉片)，操作較好的情況下每5 ml體系可獲得約50-70萬個原生質體(不同植物不同操作會有一定的差異)，可滿足約25-70個樣品的原生質體質粒轉染操作(按照每樣1-2萬個細胞計算)。

原生質體轉化時，本試劑盒可以用于相當于6孔板40個孔的樣品，12孔板80個孔的樣品，或24孔板160個孔的樣品的轉化。

● 貯存和效期：

-20oC保存，至少一年有效。

組分I，II，III，V 4℃存放3-5天不會影響使用效果，長期不用，按照標簽℃貯存。

試劑盒常溫運輸。

● 使用說明：

   需要準備的材料（試劑盒不提供）：

   剪尖吸頭（剪尖后可以用酒精燈過火將吸頭處理平滑）；纖維素酶R-10；離析酶R-10；平頭鑷子；70μm細胞過濾篩；一次性刀片；50ml離心管；1.5ml離心管；水浴鍋。

一、原生質體分離：

即用型酶溶液配制

注：即用型酶溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，不建議配制后凍存后再使用；

溶解好的正常酶溶液應為澄清棕黃色溶液，如使用純度不好的酶，溶液為不溶解的乳白色懸濁液，不能使用。

1. 酶解：

取生長狀態(tài)良好的葉片切成0.5-1 mm的小條，按照0.1 克葉片（擬南芥約15-20個葉片）加5 ml即用型酶溶液的比例迅速將切割好的葉片小條浸泡于酶溶液中，避光，無需震蕩，常溫（20-25℃）酶解3小時，間歇混勻。

注：酶解時間與葉片種類，葉片生長狀態(tài)有關，請根據(jù)實驗需要適當調整酶解時間。3小時為擬南芥葉片推薦的酶解時間。如條件允許，可以使用微型真空泵常溫避光條件下抽真空30 min，以使酶溶液更好地進入細胞間隙。酶溶液變?yōu)榫G色表明有原生質體已經有分離，溶液為濃綠色表明原生質體已經大量分離。擬南芥原生質體大小約為30-50 μm，顯微鏡鏡檢后確定是否分離。葉片原生質體細胞顯微鏡下為綠色圓球狀，葉綠體分散在整個細胞內，說明狀態(tài)較好；如呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，說明原生質體破碎或即將破碎。

2. 漂洗：

酶解后加入等體積的溶液II，如使用5 ml酶解體系，加入5 ml溶液II，輕柔混勻。

3. 過濾：

用孔徑70 μm篩網過濾步驟2中的溶液，去除未消化的葉片，收集濾出液于50 ml離心管中。

4. 第一次收集：

濾出液100g常溫離心 2分鐘，盡量去除上清。

注：為了避免原生質體離心時貼在管壁，建議整個實驗過程使用水平轉頭；離心時，可調低離心機的升速和降速。升速過快，原生質體可能離到管壁上；降速過快，可能導致管底原生質體懸起。

5. 第二次收集：

加入2-5 ml 溶液II，用剪尖的藍吸頭重懸原生質體，冰浴30分鐘，原生質體在重力作用下可以沉降到離心管底部，盡量吸除上清，收集原生質體。(如果發(fā)現(xiàn)原生質體沉降的速度比較慢或者得率比較低，也可以考慮常溫100 g離心1-2 min收集原生質體)。

6. 重懸：

小心去除上清溶液，不要觸動原生質體沉淀，沉淀用剪尖的藍吸頭重懸于1 ml溶液III中即為原生質體溶液。（可以用血球計數(shù)板計數(shù)，根據(jù)原生質體數(shù)量調整溶液III的加入體積，使得原生質體密度為2×10⁵/ml或更高）。

注：制備好的原生質體可以在4oC或冰浴保存至少24 h。

二、原生質體轉化和培養(yǎng)：

  1. 轉化溶液配制：

植物原生質體轉化參考下表根據(jù)樣品量配制轉化溶液。

轉化溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。轉化溶液需要在轉化前至少1小時配制，以確保轉化試劑溶解充分。轉化溶液配制后盡量當天使用。配制好的轉化溶液4℃保存3-5天之內仍然有較好的轉化效率，但和當天配制的轉化溶液相比，轉化效果可能會有一定程度的下降。

2. 準備質粒：

取10 μl質粒DNA(10-20 μg，濃度為1-2 μg/μl)于1.5 ml 離心管中。

注：質粒大小建議為5-10 kb，質粒濃度為1-2 μg/μl左右；

原生質體轉化對于質粒的純度要求較高，盡量使用高純度的質粒。

3. 質粒轉化：

3.1 質粒管中加入100 μl原生質體溶液（原生質體密度為2×10⁵/ml，約2萬個原生質體），輕柔混勻。

3.2 加入等體積即110 μl 步驟1事先準備好的轉化溶液，輕彈管底，輕柔混勻，常溫25℃放置5-15分鐘。

注：最長可以孵育15 min，但通常孵育5min時間已經足夠。最佳的孵育時間對于不同的原生質體和不同的質粒需要通過實驗摸索。

4. 終止轉化：

加入2倍體積即440 μl 溶液II，輕柔徹底混勻，終止轉化過程。

5. 收集原生質體：

常溫100g離心1-2分鐘，盡量去除上清。

注：由于轉化后的溶液會非常粘稠，加入溶液II后離心1 min通常可以使原生質體聚集在管底，但使用某些突變體時為減少原生質體損失，可將離心時間延長到2 min。

6. 原生質體漂洗：

  加入500 μl溶液II輕輕重懸原生質體，常溫100g離心1 min，盡量去除殘留的上清。注：本步驟可以充分去除殘留的轉染試劑溶液中的組分，避免轉染試劑溶液中的組分對于后續(xù)的不良影響。

7. 原生質體重懸：

沉淀中加入1 ml溶液V，輕柔重懸。

8. 原生質體培養(yǎng)：

將離心管水平放置，23-25oC弱光培養(yǎng)。

注：根據(jù)實驗需求確定孵育時間。RNA分析孵育2-6小時；酶活性分析和蛋白標記實驗孵育2-16小時；基因編輯的效果在轉染24小時后可能被檢測到。

三、實驗示例：

 使用原生質體植物原生質體制備及轉化試劑盒轉染擬南芥原生質體的效果圖。

實驗步驟：稱取0.48 g轉化試劑于2 ml 離心管中，加入轉化試劑溶解液后，顛倒混勻，蒸餾水定容至2 ml，使轉化試劑充分溶解后備用。在2 ml的圓底離心管中加入10 μl（20 μg）EGFP質粒 (植物用綠色熒光蛋白)，加入100 μl制備好的原生質體，輕柔混勻后加入110 μl當日配制好的轉化試劑溶液，輕柔混勻，常溫靜置5 min后加入440 μl溶液II終止轉化，輕輕顛倒混勻，常溫100 g離心1 min，去除上清，再加入0.5 ml溶液II，輕柔重懸原生質體，常溫100 g離心1 min后，盡量去除上清，收集原生質體。加入1 ml溶液V，小心重懸原生質體后水平放置25℃培養(yǎng)過夜(約16h)，次日于熒光顯微鏡下檢測EGFP熒光信號。

纖維素酶R-10

離析酶R-10

果膠酶Y-23

一次性細胞過濾篩

不銹鋼細胞過濾篩

植物原生質體提取試劑盒發(fā)表文章列表（14篇）

1. [IF=3.19] TaEXPB7-B,a -expansin gene involved in low-temperature stress and abscisic acid responses, promotes growth and cold resistance in Arabidopsis thaliana.

實驗植物：小麥

Author: Xu Feng, Yongqing Xu, Lina Peng, Xingyu Yu, Qiaoqin Zhao, Shanshan Feng, Ziyi Zhao, Fenglan Li, Baozhong Hu.

Journal: J Plant Physiology 2019

Institution：  College of Life Sciences, Northeast Agricultural University

Paper link：http://www.plantphysiol.org/content/174/4/2487

2. [IF=5.36] Involvement of the chloroplast gene ferredoxin 1 in multiple responses of Nicotiana benthamiana to Potato virus X infection. 

實驗植物：煙草

Author: Xue Yang, Yuwen Lu, Fang Wang, Ying Chen, Yanzhen Tian, Liangliang Jiang, Jiejun Peng, Hongying Zheng, Lin Lin, Chengqi Yan, Michael Taliansky, Stuart MacFarlane, Yuanhua Wu,  Jianping Chen and Fei Yan

Journal: Journal of Experimental Botany, 2020，Vol.71, No. 6,2142–2156, 

Institution：Institute of Plant Virology, Ningbo University 

Paper link：https://academic.oup.com/jxb/article/71/6/2142/5686178?login=true

3. [IF=7.228]  Turnip mosaic virus impairs perinuclear chloroplast clustering to facilitate viral infection

實驗植物：煙草

Author:Yushan Zhai, Quan Yuan, Shiyou Qiu, Saisai Li, Miaomiao Li, Hongying Zheng, Guanwei Wu, Yuwen Lu, Jiejun Peng, Shaofei Rao, Jianping Chen, Fei Yan

Journal: Plant Cell Enviroment, 2021，30 July 

Institution：Institute of Plant Virology, Ningbo University 

Paper link：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pce.14157

4. [IF=5.64]  A Novel, Small Cysteine-Rich Effector, RsSCR10 in Rhizoctonia solani Is Sufficient to Trigger Plant Cell Death

實驗植物：水稻

Author:Xianyu Niu, Guijing Yang, Hui Lin, Yao Liu, Ping Li and Aiping Zheng

Journal: Fronties in Microbiology August 2021 | Volume 12 | Article 684923 

Institution：Sichuan Agricultural University

Paper link：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2021.684923/full

5. [IF=9.8]  Synthesis of flavour-related linalool is regulated by PpbHLH1 and associated with changes in DNA methylation during peach fruit ripening

實驗植物：煙草

Author: Chunyan Wei, Hongru Liu, Xiangmei Cao, Minglei Zhang, Xian Li, Kunsong Chen and Bo Zhang

Journal: Plant Biotechnology Journal (2021) 19, pp. 2082–2096 

Institution：Laboratory of Fruit Quality Biology/Zhejiang Provincial Key Laboratory of Horticultural Plant Integrative Biology, Zhejiang University

Paper link：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13638

6. [2020IF=1.04]  EoPHR2, a Phosphate Starvation Response Transcription Factor, Is Involved in Improving Low-Phosphorus Stress Resistance in Eremochloa ophiuroides

實驗植物：擬南芥

Author: Ying Chen1,#, Chuanqiang Liu1,#, Qingqing He1, Jianjian Li2, Jingjing Wang2, Ling Li2, Xiang Yao2, Shenghao Zhou3, Haoran Wang

Journal: Phyton Vol.91, No.3, 2022, pp.651-665

Institution： Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences

Paper link：https://www.techscience.com/phyton/v91n3/45309

7. [2021IF=3.2]  Establishment and optimization of PEG-mediated protoplast transformation in the microalga Haematococcus pluvia

實驗材料：雨生紅球藻 Haematococcus pluvia

Author: Chunli Guo，Muhammad Anwar， Rui Mei，Xinyi Li， Di Zhao，Yanan Jiang， Jieyi Zhuang， Chen Liu，Chaogang Wang， Zhangli Hu

Journal: Journal of Applied Phycology. Published online 07 March 2022

Institution：College of Optoelectronic Engineering, Shenzhen University

Paper link： https://link.springer.com/article/10.1007/s10811-022-02718-x

8. [2021 IF=5.9] The Genome-Wide Identification of Long Non-Coding RNAs Involved in Floral Thermogenesis in Nelumbo nucifera Gaertn

實驗材料：睡蓮 Nelumbo nucifera Gaertn

Author: Jing Jin , Yu Zou, Ying Wang, Yueyang Sun, Jing Peng and Yi Ding

Journal: Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 4901.

Institution：College of Life Sciences, Guizhou University，College of Life Sciences, Wuhan University

Paper link： https://www.mdpi.com/1422-0067/23/9/4901

9. [2021 IF=17.9] Genome-wide association analysis reveals a novel pathway mediated by a dual-TIR domainprotein for pathogen resistance in cotton

實驗材料：棉花

Author: Yihao Zhang, Yaning Zhang, Xiaoyang Ge, Yuan Yuan, Yuying Jin, Ye Wang, Lihong Zhao, Xiao Han, Wei Hu, Lan Yang, Chenxu Gao, Xi Wei, Fuguang Li, Zhaoen Yang

Journal: Genome Biology  (2023) 24:111

Institution：Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultura Sciences

Paper link： https://doi.org/10.1186/s13059-023-02950-9

10. [2022 IF=7.4] Rose long noncoding RNA lncWD83 promotes flowerin by modulating ubiquitination of the floral repressor RcMYC2L

實驗材料：Rose 玫瑰

Author: Chen Yeqing ,Lu  Jun ,Wang Weinan ,Fan Chunguo ,Yuan Guozhen ,Sun  Jingjing ,Liu  Jinyi ,Wang Changquan

Journal: Plant Physiol (2023) Published: 19 September 2023

Institution：College of Horticulture, Nanjing Agricultural University

Paper link： https://doi.org/10.1093/plphys/kiad502

11. [2022 IF=17.4] Functionalized carbon nano-enabled plant ROS signal engineering for growth / defense balance

實驗材料：擬南芥

Author: Zhijiang Guo , Qiong Chen , Taibo Liang , Baoyuan Zhou , Suhua Huang , Xiufeng Cao, Xiuli Wang , Zaisong Ding, Jiangping Tu

Journal: Nano Today 53 (2023) 102045

Institution：School of Materials Science and Engineering, Zhejiang University

Paper link：https://doi.org/10.1016/j.nantod.2023.102045

12. [2022 IF=13.8] Unveiling the mechanism of broad-spectrum blast resistance in rice: The collaborative role of transcription factor OsGRAS30 and histone deacetylase OsHDAC1

實驗材料：水稻

Author: Jiaqi Hou, Huangzhuo Xiao, Peng Yao, Xiaoci Ma, Qipeng Shi, Jin Yang, Haoli Hou and Lijia Li

Journal: Plant Biotechnology Journal (2024), pp. 1–17

Institution：State Key Laboratory of Hybrid Rice, College of Life Sciences, Wuhan University

Paper link：https://doi.org/10.1111/pbi.14299

13. [2022 IF=7.2] NnSnRK1-NnATG1-mediated autophagic cell death governs flower bud abortion in shaded lotus

實驗材料：荷花

Author: Xiehongsheng Li, Yingchun Xu, Zongyao Wei, Jiaying Kuang, Mingzhao She, Yanjie Wang and Qijiang Jin

Journal: Plant J (2024) 117, 979–998

Institution：College of Horticulture, Nanjing Agricultural University

Paper link： https://doi.org/10.1111/tpj.16655

14. [2022 IF=7.5] The dynamic TaRACK1B-TaSGT1-TaHSP90 complex modulates NLR-protein-mediated antiviral immunity in wheat.

實驗材料：小麥

Author: Haichao Hu, Tianye Zhang, Jinnan Wang, Jun Guo, Yaoyao Jiang, Qiansheng Liao, Lu Chen, Qisen Lu,Peng Liu, Kaili Zhong, Jiaqian Liu, Jianping Chen, Jian Yang

Journal: Cell Reports 43, 114765, October 22, 2024

Institution：Institute of Plant Virology, Ningbo University

Paper link： https://doi.org/10.1016/j.celrep.2024.114765