超低分子量蛋白Marker IV（3.3-45kD）
●產(chǎn)品編號(hào)及規(guī)格：
RTD6127 10T（50μl）
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● 儲(chǔ)存條件： -20℃保存，開封后有效期12個(gè)月。
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：本產(chǎn)品包含2種多肽和3種低分子量蛋白質(zhì)組成，分子量范圍為3.3kD-45kD。可以用來(lái)判斷 SDS-PAGE上多肽和小蛋白的分子量。
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● 使用說(shuō)明：
第一次收到該產(chǎn)品，室溫融化后，徹底混勻，離心快甩將溶液完全收集到管底；本產(chǎn)品每次使用前，要95℃加熱處理5分鐘。
一. 制膠：
I 配制分離膠
1．按照表一將不同體積的雙蒸水、40%PAA（19:1）、凝膠緩沖液和乙二醇加入到小燒杯中混合。
2．加入10%APS和TEMED，立即混勻5-10秒，以使溶液充分混勻。
3．在凝膠模具中迅速灌入適量分離膠溶液，然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-3 cm的水層，使凝膠表面保持平整。
4．靜置5-10分鐘，待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面表示凝膠已聚合。
表一 （一塊0.75mm mini膠用量）
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分離膠
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濃縮膠
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18％T, 5%C /6.0 ml
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5％T, 3.3%C/2 ml
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40% PAA（19:1）
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2.7 ml
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/
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40% PAA (29:1)
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/
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0.25 ml
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4×多肽電泳凝膠緩沖液
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1.5 ml
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0.5 ml
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乙二醇（電泳級(jí)）
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1.8 ml
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/
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ddH2O
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/
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1.25 ml
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10％APS
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50-65 μl
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20 μl
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TEMED
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6 μl
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2 μl
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注：如非必須，不要使用1.0mm和1.5mm的凝膠，盡量使用厚度0.75mm的凝膠，這樣會(huì)減少電泳后染色和脫色的時(shí)間。
II 配制濃縮膠
去除覆蓋在分離膠上的水層，用濾紙將殘留的水吸去。
1．按照表一將不同體積的雙蒸水、40%PAA（29:1）和凝膠緩沖液加入到小燒杯中混合。
2．加入10%過(guò)硫酸銨和TEMED，立即混勻5-10秒，以使溶液充分混勻。
3．將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。
4．靜置20-30分鐘裝待凝膠聚合
二. 電泳：
1. 取一管分裝好的Marker樣品，徹底融化，95℃加熱處理5分鐘，充分混勻后備用。1mm厚度凝膠10齒梳子推薦上樣5μl，其他厚度和梳子調(diào)整后上樣。
2. 電泳前，將10×Tris-Tricine-SDS電泳緩沖液（Cat No：CB010）用蒸餾水稀釋成1×緩沖液備用。將電泳槽的內(nèi)外槽加入1×緩沖液，輕柔拔出梳子，將Marker或蛋白樣品（樣品已經(jīng)過(guò)2×Tricine上樣緩沖液[Cat No：TP050]處理）加入點(diǎn)樣孔，根據(jù)表二條件進(jìn)行電泳，至藍(lán)色指示前沿至分離膠3/4位置時(shí)即可停止電泳。整個(gè)電泳過(guò)程大約需要2-3個(gè)小時(shí)。注：如果電泳時(shí)間過(guò)短，染色時(shí)，指示前沿容易遮擋小于5kd的小肽。
表二 多肽電泳條件
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恒電壓
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150 V
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起始電流
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45-55 mA
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結(jié)束電流
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10-15 mA
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電泳時(shí)間
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2-3小時(shí)
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三. 染色
根據(jù)常規(guī)實(shí)驗(yàn)步驟，用配方5和6（表三）進(jìn)行染色和觀察。如果使用配方5進(jìn)行染色時(shí)效果不好或考慮其毒性，請(qǐng)選擇本公司的FastBlue蛋白染色液（Cat No：RTD6202），該產(chǎn)品能在5分鐘之內(nèi)完成蛋白的染色，不至于小肽在染色和脫色中從凝膠中脫離，是常規(guī)染色液的理想替代品。
表三 小分子蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳試劑配制
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1. 40%PAA（29:1）（配制濃縮膠）
Cat No:AC2914
丙稀酰胺 38.67g
甲叉雙丙稀酰胺 1.33g
用ddH2O溶解后定容至100
ml，過(guò)濾后使用。
貯存：4℃避光保存
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2. 40% PAA（19:1） （配制分離膠）
Cat No:AC1914
丙稀酰胺 38 g
甲叉雙丙稀酰胺 2 g
用ddH2O溶解后定容至100
ml，過(guò)濾后使用。
貯存：4℃避光保存
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3. 4×多肽電泳凝膠緩沖液（配制凝膠用）
[3MTris; 0.4% SDS; pH8.45]
Cat No:GB010
Tris堿 36.3 g；
ddH2O 80ml
0.4 g SDS或4 ml 10％SDS
用HCl調(diào)pH值至8.45；用ddH2O定容至100 ml
貯存：4℃
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4. 10×Tris-Tricine-SDS電泳緩沖液
[1MTris;1MTricine ;1% SDS; pH 8.3]
Cat No:CB010
Tris堿 121.14g
Tricine 179.2g
SDS10g
用ddH2O溶解，定容至1000ml(不用調(diào)pH)。
貯存：4℃
注：使用前稀釋成1×緩沖液使用
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5. 染色液
冰醋酸 100 ml
甲醇 450 ml
考馬斯亮藍(lán)G-250 0.25
g
水 450 ml
6. 脫色液
冰醋酸 100ml
水 900ml
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7. 2×Tricine蛋白樣品上樣緩沖液（10ml）
Cat No:TP050
1ml 1MTris-Cl pH6.8
2.4ml 甘油
0.8g SDS
0.31g DTT（或者400μl β-巰基乙醇）
2mg 考馬斯亮藍(lán)G-250
用滅菌ddH2O定容至10ml
混勻分裝-20℃貯存?zhèn)溆?/span>
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超低分子量蛋白MarkerIV附加說(shuō)明
由于小肽的氨基酸數(shù)目較少，表觀分子量受氨基酸種類影響很大，同一小肽在不同的電泳系統(tǒng)中表現(xiàn)為分子量大小可能不一樣。超低分子量蛋白Marker IV中的倒數(shù)第二條帶即為這種情況。在使用4×多肽電泳凝膠緩沖液加乙二醇的凝膠系統(tǒng)中（RTD6127附帶說(shuō)明書系統(tǒng)），表觀分子量為10KD（上圖左）；而在使用超低分子量試劑盒系統(tǒng)（RTD6120）電泳時(shí)，表觀分子量為5.5KD（上圖右）。
多肽電泳配套試劑
使用RTD6127超低分子量蛋白Marker IV(3.3-45kD)蛋白Marker產(chǎn)品發(fā)表部分文章列表：
1. [2021 IF=2.99] Purifcation,
characterization, and action mechanism of plantaricin DL3, a novel bacteriocin
against Pseudomonas aeruginosa produced by Lactobacillus plantarum DL3 from
Chinese Suan Tsai.
Author: Xinran Lv, Yang Lin ,Yu Jie, Mengtong Sun, Bolin Zhang,Fengling
Bai,Hongfei Zhao,Jianrong Li
Marker: RTD6127，超低分子量蛋白Marker
IV（3.3-45 kD）
Journal: European Food Research and Technology. Vol
244, pages 323–331 (2018)
Institution：College of Biological
Science and Biotechnology, Beijing Forestry University
Paper link：https://link.springer.com/article/10.1007/s00217-017-2958-3