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Western一抗二抗去除液(強(qiáng)堿,劇烈型)

Western一抗二抗去除液(強(qiáng)堿,劇烈型)

產(chǎn)品編號:WS1100-500ml

產(chǎn)品規(guī)格:500ml

相關(guān)規(guī)格:
數(shù)量
價格 ¥200

Western一抗二抗去除液(強(qiáng)堿,劇烈型)

貨號

名稱

規(guī)格

WS1100-100ml

Western一抗二抗去除液(強(qiáng)堿,劇烈型)

100 ml

WS1100-500ml

Western一抗二抗去除液(強(qiáng)堿,劇烈型)

500 ml








產(chǎn)品簡介:

Western一抗二抗去除液(強(qiáng)堿,劇烈型)(Western Antibody Stripping Buffer,basic,harsh type)可以高效去除印跡膜上的一抗和二抗,而吸附在膜上的抗原基本不受影響,用于Western中轉(zhuǎn)移了蛋白膜的重復(fù)利用,可以轉(zhuǎn)一次膜,做多次Western印跡實驗,通??梢灾貜?fù)利用膜3-5(PVDF膜)。使用本試劑只需大約5-10分鐘(NC膜)或15-20分鐘(PVDF膜)即可實現(xiàn)蛋白膜的重復(fù)使用,然后可以進(jìn)行Western的后續(xù)操作。

該產(chǎn)品具有以下幾個優(yōu)點:

1.可用于昂貴或珍稀樣本的多次雜交;

2.有利于用不同抗體分析單次印跡上的不同蛋白,比如不同亞型的抗體;

3.有利于對異常結(jié)果進(jìn)行重新分析或確認(rèn);

4.有利于糾正孵錯的抗體;

5.節(jié)約試劑成本,并節(jié)約時間。

各種去除液的選擇請點擊Western一抗二抗去除液選擇指南。

貯存:

   常溫貯存,有效期一年;常溫運輸。

● 用前必讀:

1. 理想的抗體去除液應(yīng)該是洗脫抗體的同時,不洗脫膜上結(jié)合的蛋白或者不改變抗原的結(jié)合性質(zhì),但是目前沒有一種去除液可以做到只洗脫抗體,而完全不洗脫膜上結(jié)合的抗原;也沒有一種去除液可以適用于所有不同親和度的抗原抗體復(fù)合物。去除液洗脫能力太強(qiáng),抗原也容易被洗脫;太弱,則抗體殘留太高。因此,從免疫印跡膜上去除抗體的方案僅能用于定性用途,因為在每個抗體清除循環(huán)中,或多或少都將洗去少量膜上的蛋白。

2. PVDF膜比硝酸纖維素膜(NC膜)更堅韌,因此優(yōu)先推薦使用PVDF膜用于涉及抗體剝離的實驗。

3. 從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)印完成后立即干燥PVDF膜或NC膜,可改善蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合,特別推薦用于涉及多次抗體剝離的實驗。在第一輪抗體檢測之前,必須使用甲醇將干燥的PVDF膜潤濕或用1×TBST將干燥的NC膜潤濕。已經(jīng)結(jié)合有抗體的膜,決不能使得膜干燥,否則抗體分子將與膜結(jié)合緊密,很難剝離。因此,在做完一輪ECL發(fā)光檢測實驗后,需要用清除液清除掉膜上的抗體,推薦將膜浸泡于1×TBS(非1×TBST)中4度保存。

4. 檢測時,優(yōu)先檢測低豐度抗原:先孵育條帶較弱(表達(dá)較低)的蛋白,再孵育條帶明顯(表達(dá)較高)的蛋白,最后再孵育內(nèi)參。

5. 如條件允許,下一輪的抗體雜交實驗選擇種屬來源不同的一抗(對應(yīng)不同種屬的二抗),減少檢測的交叉反應(yīng)。

6. 該清除液適用于ECL發(fā)光檢測的膜上抗體清除,不適合于膜上直接顯色(DAB,BCIP/NBT等),不適合熒光檢測。

使用說明:

1. 在完成Western化學(xué)發(fā)光檢測后,NC膜或PVDF膜用適量蒸餾水中震蕩漂洗5分鐘;重復(fù)漂洗2次。

2. 棄蒸餾水,加入適量的Western一抗二抗去除液,在搖床上震蕩漂洗清除抗體。

孵育溫度和時間會明顯影響抗體去除效果,參照下表調(diào)整。

膜類型

操作溫度

震蕩清除時間

備注

NC

18

15分鐘以上

冬天實驗室氣溫低時

25

5-10 分鐘

常規(guī)樣品操作

PVDF

18

25分鐘以上

冬天實驗室氣溫低時

25

15-20 分鐘

常規(guī)樣品操作

3. 棄去除液,加入足量蒸餾水,在搖床上漂洗2次,每次5分鐘,把去除液徹底漂洗干凈。

  注:殘余的去除液會影響后續(xù)抗原抗體的的結(jié)合。

4. 可選步驟:漂洗后的轉(zhuǎn)印膜孵育ECL發(fā)光液,檢測二抗的清除效率。曝光5分鐘,膜上看不到發(fā)光條帶表明二抗清除得比較干凈。如果膜上能看到條帶,重復(fù)步驟2-3。

5.繼續(xù)進(jìn)行Western的后續(xù)操作(封閉-抗體孵育-發(fā)光檢測)。

   注:建議每次膜剝離后都要進(jìn)行重新封閉,以降低背景。優(yōu)先選用5%脫脂奶粉(貨號:WN1070)封閉,推薦常溫封閉1小時;使用Western無蛋白快速封閉液(貨號:PF1070)時,NC膜需要封閉60分鐘;PVDF膜可以封閉10分鐘。

實驗示例:


Western一抗二抗去除液(堿性,劇烈型)檢測效果圖

Western一抗二抗清除液(堿性,劇烈型)檢測效果圖

樣品:K562細(xì)胞,SDS裂解液(貨號:RL1060)提取總蛋白;

電泳:4-20% RealPAGE預(yù)制膠(貨號:RTD6117-0420), 200 V 1×TGS  56 min

轉(zhuǎn)膜:NC膜,1×RealBlot快速轉(zhuǎn)膜液(貨號:RT5020)400 mA 40 min

圖1:5%脫脂奶粉封閉液(貨號:WN1070)  RT  60 min;一抗:Santa β-Actin鼠單抗(SC-47778) 1:2000  RT 60min;二抗:羊抗鼠IgG-HRP 1:5000(貨號:HGM1060)  RT 60min;ECL自動曝光3秒

圖2:膜加入Western一抗二抗清除液(堿性,劇烈型),第1次清除,常溫25度,搖床5 min,ECL自動曝光5分鐘,膜上二抗條帶去除干凈。

圖3:5%脫脂奶粉封閉液(貨號:WN1070),常溫?fù)u床60分鐘,PCNA 1:5000(貨號:APM5012)  RT 60min,羊抗鼠IgG-HRP 1:5000 (貨號:HGM1060)RT 60min,自動曝光11秒,β-actin和PCNA同時有條帶,說明圖二中actin一抗沒有完全去除干凈。

圖4:膜加入Western一抗二抗清除液(堿性,劇烈型),常溫24度 5 min第2次清除抗體,

Western無蛋白快速封閉液(貨號;PF1070)RT 60分鐘,一抗:Santa β-Actin鼠單抗(SC-47778) 1:4000 RT 60min,羊抗鼠IgG-HRP 1:5000(貨號:HGM1060)  RT 60min;ECL自動曝光6秒。

圖5:膜加入Western一抗二抗清除液(堿性,劇烈型)第3次清除 26度 5min,

一抗:Santa β-Actin鼠單抗(SC-47778) 1:4000  RT 60min;

二抗:羊抗鼠IgG-HRP 1:5000(貨號:HGM1060)  RT 60min;ECL自動曝光3分鐘。


 
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