Western一抗二抗去除液（弱堿，溫和型）

● 產(chǎn)品簡介：

Western一抗二抗去除液（弱堿，溫和型）(Western Antibody Stripping Buffer，weak alkaline，mild type)可以高效去除印跡膜上的一抗和二抗，而吸附在膜上的抗原基本不受影響，用于Western中轉(zhuǎn)移了蛋白膜的重復(fù)利用，可以轉(zhuǎn)一次膜，做多次Western印跡實(shí)驗(yàn)，通常可以重復(fù)利用膜5-8次（PVDF膜）。使用本試劑只需大約30分鐘即可實(shí)現(xiàn)蛋白膜的重復(fù)使用，然后可以進(jìn)行Western的后續(xù)操作。

該產(chǎn)品具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：

1.可用于昂貴或珍稀樣本的多次雜交；

2.有利于用不同抗體分析單次印跡上的不同蛋白，比如不同亞型的抗體；

3.有利于對(duì)異常結(jié)果進(jìn)行重新分析或確認(rèn)；

4.有利于糾正孵錯(cuò)的抗體；

5.節(jié)約試劑成本，并節(jié)約時(shí)間。

各種去除液的選擇請(qǐng)點(diǎn)擊Western一抗二抗去除液選擇指南。

● 貯存：

   常溫貯存，有效期一年；常溫運(yùn)輸。

● 用前必讀：

1. 理想的抗體去除液應(yīng)該是洗脫抗體的同時(shí)，不洗脫膜上結(jié)合的蛋白或者不改變抗原的結(jié)合性質(zhì)，但是目前沒有一種去除液可以做到只洗脫抗體，而完全不洗脫膜上結(jié)合的抗原；也沒有一種去除液可以適用于所有不同親和度的抗原抗體復(fù)合物。去除液洗脫能力太強(qiáng)，抗原也容易被洗脫；太弱，則抗體殘留太高。因此，從免疫印跡膜上去除抗體的方案僅能用于定性用途，因?yàn)樵诿總€(gè)抗體清除循環(huán)中，或多或少都將洗去少量膜上的蛋白。

2. PVDF膜比硝酸纖維素膜（NC膜）更堅(jiān)韌，因此優(yōu)先推薦使用PVDF膜用于涉及抗體剝離的實(shí)驗(yàn)。

3. 從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)印完成后立即干燥PVDF膜或NC膜，可改善蛋白質(zhì)與膜的結(jié)合，特別推薦用于涉及多次抗體剝離的實(shí)驗(yàn)。在第一輪抗體檢測之前，必須使用甲醇將干燥的PVDF膜潤濕或用1×TBST將干燥的NC膜潤濕。已經(jīng)結(jié)合有抗體的膜，決不能使得膜干燥，否則抗體分子將與膜結(jié)合緊密，很難剝離。因此，在做完一輪ECL發(fā)光檢測實(shí)驗(yàn)后，需要用清除液清除掉膜上的抗體，推薦將膜浸泡于1×TBS（非1×TBST）中4度保存。

4. 檢測時(shí)，優(yōu)先檢測低豐度抗原：先孵育條帶較弱（表達(dá)較低）的蛋白，再孵育條帶明顯（表達(dá)較高）的蛋白，最后再孵育內(nèi)參。

5. 如條件允許，下一輪的抗體雜交實(shí)驗(yàn)選擇種屬來源不同的一抗（對(duì)應(yīng)不同種屬的二抗），減少檢測的交叉反應(yīng)。

6. 該清除液適用于ECL發(fā)光檢測的膜上抗體清除，不適合于膜上直接顯色（DAB，BCIP/NBT等），不適合熒光檢測。

● 使用說明：

1. 在完成Western化學(xué)發(fā)光檢測后，NC膜或PVDF膜用適量蒸餾水中震蕩漂洗5分鐘；重復(fù)漂洗2次。

2. 棄蒸餾水，加入適量的Western一抗二抗去除液，根據(jù)下表操作。孵育溫度和時(shí)間會(huì)明顯影響抗體去除效果，參照下表調(diào)整。

3. 棄去除液，加入足量蒸餾水，在搖床上漂洗2次，每次5分鐘，把去除液徹底漂洗干凈。

  注：殘余的去除液會(huì)影響后續(xù)抗原抗體的的結(jié)合。

4. 可選步驟：漂洗后的轉(zhuǎn)印膜孵育ECL發(fā)光液，檢測二抗的清除效率。曝光5-10分鐘，膜上看不到發(fā)光條帶表明二抗清除得比較干凈。如果膜上能看到條帶，重復(fù)步驟2-3。

5．繼續(xù)進(jìn)行Western的后續(xù)操作（封閉-抗體孵育-發(fā)光檢測）。

   注：建議每次膜剝離后都要進(jìn)行重新封閉，以降低背景。

● 實(shí)驗(yàn)示例：

樣品：K562細(xì)胞,SDS裂解液（貨號(hào)：RL1060）提取總蛋白；

電泳：4-20% RealPAGE預(yù)制膠（貨號(hào)：RTD6117-0420）電泳

轉(zhuǎn)膜：NC膜，1×RealBlot快速轉(zhuǎn)膜液（貨號(hào)：RT5020）快速濕轉(zhuǎn)，恒流400 mA 30 min

圖1：Western快速封閉液（貨號(hào)：WR5020）RT 快封  15 min；一抗：β-Actin鼠單抗 1:10000  RT 60min；二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min；ECL（貨號(hào)：EC2520）曝光1秒。

圖2： Western一抗二抗去除液（弱堿，溫和型） RT 20分鐘剝離，ECL曝光11分鐘，二抗去除干凈。

圖3： Western快速封閉液（貨號(hào)：WR5020）RT 快封20分鐘；一抗：PCNA鼠單抗1：5000 RT 60min，二抗羊抗鼠IgG-HRP 1:5000，ECL（貨號(hào)：EC2520）曝光1秒。

圖4： 膜第二次剝離RT 30分鐘，ECL自動(dòng)曝光11min ，二抗去除干凈

圖5： Western快速封閉液（貨號(hào)：WR5020）RT 快封30min；一抗：GAPDH兔多抗 1:3000 60min，二抗：羊抗兔IgG-HRP RT 60min，ECL曝光2分16秒。

Western一抗二抗去除液（弱堿，溫和型） PVDF膜測試

樣品：K562細(xì)胞,SDS裂解液(貨號(hào)：RL1060)提取總蛋白

電泳條件：12% RealPAGE預(yù)制膠（貨號(hào)：RTD6117-0012）， 恒壓150 V 1×TGS  73 min

轉(zhuǎn)膜條件：PVDF膜 孔徑0.45μm，1×RealBlot快速轉(zhuǎn)膜液（貨號(hào)：RT5020） 恒流400 mA 30 min

封閉：無蛋白快速封閉液（貨號(hào)：PF1070）常溫封閉10 min

膜去除抗體程序：37度，搖床60rpm 10分鐘

圖1：一抗：PCNA鼠單抗 1:5000，RT 60min；二抗：羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min，ECL曝光1秒

圖2：膜第1次清除后抗體去除效果檢測：膜水漂洗3次，加入5 ml抗體去除液去除抗體，TBST漂洗3次，ECL曝光5分鐘，膜上幾乎無可見條帶，說明二抗去除干凈。

圖3：膜第1次清除后，H3檢測： H3鼠單抗 1:10000  RT  60 min孵育，羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵育，ECL曝光5秒。

圖4：膜第2次清除后，GAPDH檢測： GAPDH兔多抗 1:3000  RT 60 min孵育，羊抗兔IgG-HRP 1:5000  RT 60min，ECL曝光150秒。

圖5：膜第3次清除后，PCNA檢測：PCNA鼠單抗 1:5000  RT  60 min孵育，羊抗鼠IgG-HRP 1:5000  RT 60min孵育，ECL曝光1秒。